ALX家族基因在人胚胎干细胞来源的神经嵴细胞中的作用研究

发布时间：2018-05-10 20:42

本文选题：人胚胎干细胞 + 神经嵴细胞　；参考：《北京协和医学院》2017年硕士论文

【摘要】：研究背景:人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)是从囊胚内细胞团(inner cell mass,ICM)中分离培养得到的一类具有亚全能分化能力的干细胞,具有自发向三胚层来源细胞分化的潜能[1],并能向特定方向诱导分化,因此hESCs在基因治疗、组织工程学和药学研究等众多领域具有广泛的应用价值[2]。神经嵴细胞(neural crest cells,NCCs)是脊椎动物胚胎发育过程中短暂存在的一类多能细胞群。在早期胚胎发育过程中,NCCs出现在神经管隆起的神经褶,而后广泛迁移到各处[3],在环境的作用下可向内、中、外三个胚层分化成多种细胞类型,包括感觉神经元、骨细胞、软骨细胞、色素细胞、肾上腺髓质细胞以及平滑肌细胞等[4]。由于NCCs可以分化发育成颅面部绝大部分骨、软骨以及结缔组织结构,因此NCCs可以作为体外研究胚胎早期颅面发育过程和机制的细胞模型。ALX基因家族属于同源框基因中PRD家族中的一个亚家族,该基因家族成员包括ALX1(Cart1)、ALX3和ALX4[5]。研究发现,该家族成员的突变会引起一种特殊的颅面部发育畸形——鼻额发育不良(Frontonasal dysplasia,FND)[6]。许多研究表明ALX基因家族在颅面部发育中起着重要的作用。但是目前ALX基因家族成员在各种细胞的表达水平和功能都尚不明确。研究目的:1.获取H9hESCs来源NCCs(H9-NCCs)并鉴定其生物学特性2.明确ALX家族基因在H9-NCCs及其来源分化细胞中的表达水平3.明确ALX基因家族成员对H9-NCCs的生物学特性的影响研究方法和结果:1.H9 hESCs来源NCCs的获取、培养和鉴定方法:利用体外同时添加Wnt通路激活剂和Smad通路抑制剂的方法将H9 hESCs诱导分化形成NCCs(H9-NCCs),观察H9hESCs及H9-NCCs的细胞形态,并通过免疫荧光染色和Real-time PCR方法鉴定H9 hESCs及其来源的H9-NCCs的特定标志物的表达。通过添加成神经和成间充质干细胞诱导分化液将H9-NCCs分别诱导分化成外胚层来源的外周神经细胞和中胚层来源的间充质干细胞(MSCs)并对得到的MSCs进行成骨成脂诱导分化,检测H9-NCCs的多向分化能力。结果:H9hESCs呈克隆样生长,边界光滑,结构致密。在诱导7天左右有菱形细胞从H9 hESCs细胞克隆边缘爬出,细胞在3-4天左右融合,标记为P0代H9-NCCs;Real-time PCR检测P4代H9-NCCs标志物的表达结果显示与hESCs相比,H9-NCCs 高表达 NCCs 标志基因 SOX9、SOX10、P75、HNK-1、AP2 和ZIC1,而低表达hESCs的标志基因NANOG和OCT4。免疫荧光染色结果显示H9-NCCs高表达NCCs标志物蛋白HNK-1和P75。体外成神经诱导分化14天后,H9-NCCs细胞变长,可观察到神经纤维状突起的形成。免疫荧光染色结果显示,分化得到的细胞高表达外周神经元标志物β-tubulin III和peripherin。H9-NCCs在MSCs分化诱导培养基中培养5-7天后可观察到细胞从NCCs的菱形转变成MSCs样的长梭形,流式细胞分析结果显示,H9-NCCs来源MSCs(H9-NCC-MSCs)高表达MSCs表面标志物CD90,CD105,CD73和CD44,不表达造血干细胞标志物CD34、CD116、CD19、CD45和HLA-DR。此外,H9-NCC-MSCs成骨诱导分化14天后经茜素红染色可观察到深红色钙结节存在,但成脂分化14天后油红O染色未见脂滴形成。2.ALX家族基因在H9hESCs,H9-NCCs及其来源分化细胞中的表达水平方法:Real-time PCR 检测 H9 hESCs、H9-NCCs、外周神经细胞、H9-NCC-MSCs及其来源成骨细胞中ALX1、ALX3和ALX4的表达水平。结果:在H9hESCs和H9-NCCs中,ALX家族基因表达量并没有明显差异,但ALX1在H9-NCCs中的表达量显著高于在H9-NCC-MSCs及其分化得到的成骨细胞中。ALX3和ALX4在表达模式上具有相似性,ALX3在H9-NCC-MSCs特异性的高表达,而ALX4在外周神经细胞和H9-NCC-MSCs及其分化得到的成骨细胞中均高表达。3.过表达ALX家族基因对H9-NCCs的生物学特性的影响方法:构建过表达ALX家族基因(ALX1,ALX3,ALX4)的慢病毒载体转染293T细胞并收集病毒感染H9-NCCs,检测过表达ALX家族基因对H9-NCCs生物学特性的影响;利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测细胞增殖能力;利用Annexin V/7-AAD染色和流式细胞分析检测细胞凋亡水平;采用Transwell法和结晶紫染色检测H9-NCCs的迁移能力。结果:ALX家族基因与H9-NCCs的增殖能力、迁移能力和凋亡水平有关。过表达ALX1,ALX3和ALX4均可显著提高H9-NCCs的迁移能力。此外,过表达ALX1还可显著提高H9-NCCs的增殖能力;而过表达ALX4可显著降低H9-NCCs的增殖能力并且提高其凋亡水平。研究结论:1.H9-hESCs经体外诱导分化形成的H9-NCCs具有NCCs的细胞形态并表达NCCs特定标志物,且具有向神经细胞和间充质细胞方向分化的潜能,提示H9-hESCs经体外诱导分化形成的H9-NCCs具有NCCs生物学特性。2.不同的ALX基因在不同分化阶段的细胞中有不同的表达谱,提示他们在胚胎发育过程中发挥的功能具有时序性和空间性。3.ALX基因家族成员(ALX1,ALX3和ALX4)对H9-NCCs的迁移能力起重要的调控作用,且三者在功能上具有重叠和不同之处。过表达ALX1,ALX3和ALX4均可显著提高H9-NCCs的迁移能力,并且ALX1和ALX4表达水平还与细胞的增殖能力有关;ALX1过表达促进H9-NCCs的增殖,而ALX4过表达可抑制H9-NCCs增殖并促进凋亡。
[Abstract]:BACKGROUND : Human embryonic stem cells ( hESCs ) are derived from the inner cell mass ( ICM ) of human embryonic stem cells ( ICM ) . It has the potential to differentiate into three - embryonic stem cells and induce differentiation in a specific direction . Therefore , hESCs has a wide application value in gene therapy , tissue engineering and pharmaceutical research . The neural crest cells ( NCCs ) are a kind of multi - cell group which is transiently present in the development of vertebrate embryos . During the early embryo development , NCCs appear in the neural folds of the neural tube and migrate widely to every place . In the environment , the three embryonic layers can be differentiated into a variety of cell types , including sensory neurons , osteocytes , chondrocytes , pigment cells , adrenomedullar cells and smooth muscle cells . Since NCCs can differentiate into the vast majority of bone , cartilage and connective tissue structures , the NCCs can be used as a cellular model for studying the process and mechanism of early embryonic development of embryos in vitro . The ALX gene family belongs to a subfamily of the PRD families in homeobox genes , and the family members include ALX1 ( Cart1 ) , ALX3 and ALX4 . It has been found that mutations in the family members may cause a special head - facial dysplasia _ ( FND ) deformity . The expression levels and functions of ALX gene family members in the differentiation of H9 - NCCs were determined by immunofluorescence staining and Real - time PCR . The expression levels of ALX1 , ALX3 and ALX4 in hESCs and H9 - NCCs were significantly higher than that of H9 - NCC - MSCs .

【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R329.2

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