志贺菌中插入序列IS600的插入特点及其对cse2基因和Cas蛋白影响的生物信息学分析

发布时间：2018-05-11 06:05

  本文选题：志贺菌 + 插入序列　； 参考：《郑州大学》2017年硕士论文

【摘要】：志贺菌属通称痢疾杆菌,是感染性腹泻的常见致病菌之一,可引起细菌性痢疾。随着各类抗生素在临床的长期和广泛使用,志贺氏菌的耐药问题日益严重。耐药基因的水平转移(horizontal gene transfer,HGT)是大多数细菌产生耐药性尤其是多重耐药性的主要方式之一。近年来研究发现的成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPRs),连同CRISPR相关基因(Cas)及其编码的Cas蛋白共同组成CRISPR/Cas免疫系统,它广泛存在于细菌和古细菌基因组中,提供抵御质粒和噬菌体等外来入侵遗传元件的获得性免疫,具有限制外源性遗传物质水平转移的作用。插入序列(insertion sequence,IS)是染色体的特殊组成部分,是最简单的高度可移动性转座因子,可携带耐药基因转移,其在基因组中的插入可能使细菌基因产生突变从而影响细菌基因的正常表达。本课题组前期研究发现志贺菌Cas蛋白基因cse2中存在插入序列IS600,且插入序列IS600可使cse2 mRNA的表达水平降低,推测IS插入cas基因可能会影响Cas蛋白的功能进而影响Cascade蛋白复合物的结构及CRISPR/Cas系统的功能。为进一步研究插入序列对CRISPR/Cas系统的影响,结合课题组前期工作,本研究欲通过对cse2基因的生物信息学分析探索插入序列IS600对Cas蛋白及整个CRISPR/Cas系统的影响,进而为解决志贺菌的耐药问题提供新思路。目的了解志贺菌中插入序列IS600在cse2基因中的的插入特点,分析其对cse2基因和Cse2蛋白的影响,并对cse2基因进行生物信息学分析。方法1.利用实验室前期设计的引物PCR扩增志贺菌株的CRISPR相关蛋白基因cse2并将琼脂糖凝胶电泳结果阳性条带样品送测序。2.应用Clustal X软件和Blast在线比对(Global Align)对测序结果进行比对。3.应用ORF Finder和ExPASy的Translate tool翻译并在线查找开放阅读框。4.应用ProtParam工具和compute工具(计算等电点和分子量)在线分析蛋白理化性质;应用ProtScale软件分析亲水性、疏水性。5.应用TMHMM Server v.2.0进行跨膜区预测;应用Pfam 31.0程序和CDD软件进行结构域预测。6.应用PredictProtein、SOPMA和PSIPRED进行二级结构的预测。7.应用SWISS-MODEL和PDBsum Generate分别进行三级结构的预测和预测模型的在线评估。结果1.39株志贺菌中,有2株细菌未检出cse2基因,有12株细菌cse2基因条带大小约为400bp,有25株细菌cse2基因条带大小约为1600bp;基因扩增产物的测序结果与GenBank中宋内志贺菌Ss046比对表明为目的基因cse2,且增加的1200bp通过测序确定为插入序列IS600的开放阅读框序列。2.插入序列IS600插入cse2基因位置从第263个碱基开始,位于cse2基因的后半部分,插入序列IS600插入cse2基因的热点为碱基TGC-GGC。3.菌株Ss046和菌株53G的cse2基因预测的开放阅读框不同,连续翻译的氨基酸序列不同,编码的蛋白质不同。4.菌株Ss046和菌株53G的Cse2蛋白的理化性质如等电点和分子量、脂溶指数、不稳定指数、亲水性和疏水性、氨基酸组成分布等都不相同。5.菌株Ss046和菌株53G两者的Cse2蛋白整条肽链都位于细胞膜之外,不存在跨膜结构,不是跨膜蛋白;菌株Ss046的Cse2蛋白具有两个结构域:HTH21(HTH-like domain)和rev(Integrase core domain),前者即HTH结构域,后者即整合酶核心领域;菌株53G的Cse2蛋白具有一个结构域:CRISPR Cse2。6.结合三种方法对菌株Ss046和菌株53G的Cse2蛋白二级结构预测的结果可知:α-螺旋和β-折叠散布于整个Cse2蛋白,成为蛋白的刚性支撑,无规则卷曲所占比例也较高,间杂少量的β-转角。但两菌株Cse2蛋白二级结构成分的比例都不同。7.Cse2蛋白三维同源结构建模显示该蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,与蛋白质二级结构预测结果相符。从构建的三级结构模型结果来看,菌株Ss046和菌株53G的Cse2蛋白的三级结构存在明显的差异。结论1.志贺菌中插入序列IS600在cse2基因中的插入存在热点位置,为碱基TGCGGC,该位置易发生突变,调控cse2基因表达。2.志贺菌中插入序列IS600插入cse2基因后,使Cas蛋白的理化性质、功能结构域以及二级结构、三级结构发生了变化,进而影响Cas蛋白的功能和Cascade复合物的结构以及整个CRISPR/Cas系统的功能。
[Abstract]:蹇楄春鑿屽睘閫氱О鐥㈢柧鏉嗚弻,鏄�鎰熸煋妫�

本文编号：1872724