蓖麻GA20-ox基因表达分析及RNAi载体转化的初步研究

发布时间：2018-05-16 08:47

  本文选题：矮化蓖麻 + GA20-氧化酶基因　； 参考：《天津科技大学》2016年硕士论文

【摘要】：随着现代农业经济的发展,蓖麻种植产业已具有向种植矮化品种栽培方式发展的趋势。矮化后的蓖麻具有在同等条件下比高秆蓖麻更强的节水、抗旱、抗倒伏、利于实现机械化收割等优势,因此,蓖麻矮化育种已成为蓖麻育种的热点之一。在植物生长发育过程中,植物激素赤霉素(GA)参与茎秆节间的发育过程,从而影响植株的高度。赤霉素20氧化酶(GA20-oxidase)是植物赤霉素生物合成的关键调节酶,决定具有生物活性GAs的合成量。本文克隆并初步研究了蓖麻中的GA-20氧化酶基因,为蓖麻矮化育种提供参考。本研究利用同源基因克隆法,克隆了 NCBI数据库已公布的蓖麻GA-20氧化酶基因的碱基序列(XM_002510827.1),通过生物信息学软件对其基因序列进行分析,表明克隆得到的是目的基因,记为RcGA20-ox。利用RT-PCR技术,分析了 GA20-氧化酶基因在蓖麻不同器官的表达量,表明RcGA20-ox基因在蓖麻种子和嫩叶中表达量最高。利用RT-qPCR技术,对RcGA20-ox基因在典型的"蓖绿2号"、"稼祥2号"、"CSR24.181"、"浙蓖17号"四种高秆和"中北4号"、"中北5号"、"天蓖26号"、"浙蓖36号"四种矮秆蓖麻品种不同时期嫩叶中的表达情况进行了分析,表明RcGA20-ox基因的表达差异,是影响植株表现高矮的重要原因之一。以蓖麻的cDNA和中间载体pHANNIBAL为模板,分别扩增得到正向片段、反向片段、内含子片段,分别记为GA20s、GA20a、Intron。使用XbaⅠ和SacⅠ酶切载体pBI121,利用In-Fusion技术,将线性载体与三个PCR片段进行连接,构建了 RNA干扰载体pBI-GA20ox-RNAi。利用DNA冻融法,将干扰载体pBI-GA20ox-RNAi转入农杆菌EHA105中,成功制备了用于侵染的农杆菌工程菌液。对蓖麻高效再生体系的重要步骤进行了优化,采用分子水平评价机制,以LECl基因的表达与再生体系实际出芽效率作为评价指标,确定了不定芽最佳诱导培养基为MS培养基+0.5mg/L6-BA+0.2mg/LIBA;研究GA3浓度对不定芽伸长的影响,确定了不定芽最适伸长培养基为MS培养基+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+0.1mg/L GA3。通过以上条件优化,诱导生根后发育成完整的蓖麻植株并移栽成活。应用自主构建的蓖麻遗传转化体系,利用真空辅助农杆菌介导转化法,使用携带RNA干扰载体的农杆菌对蓖麻胚尖进行侵染,筛选得到抗性植株16个,其概率为3.05%。通过PCR检测,得到蓖麻转基因植株5个,转化率为0.95%。通过RT-qPCR技术,初步验证了各转化植株的GA20-ox基因均不同程度受到抑制。
[Abstract]:With the development of modern agriculture economy , the castor planting industry has the tendency to develop the dwarf variety cultivation mode . The dwarf castor has the advantages of stronger water saving , drought resistance , lodging resistance and mechanical harvesting . The results showed that the optimal medium for adventitious buds was MS medium supplemented with 0.5 mg / L 6 - BA + 0.2 mg / L IBA + 0.1 mg / L GA 3 . The optimum medium was MS medium supplemented with 0.5 mg / L 6 - BA + 0.2 mg / L IBA + 0.1 mg / L GA 3 .

【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S565.6;Q943.2

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本文编号：1896201