七鳃鳗CXCL8基因的功能研究及与受体关系的验证

发布时间：2018-05-25 23:09

本文选题：海七鳃鳗 + 东北七鳃鳗　；参考：《上海海洋大学》2017年硕士论文

【摘要】：七鳃鳗是现存最古老的无颌类脊椎动物之一,是联系无脊椎动物与脊椎动物之间的重要桥梁,对其免疫系统的研究在理论上有着重要的进化意义。海七鳃鳗(Petromyzon marinus)作为典型代表之一,其全基因组测序已经完成,东北七鳃鳗(Lethenteron morii)是分布在我国东北部的与之亲缘关系接近的主要物种之一。CXCL8(白细胞介素-8,Interleukin 8)是一种促炎性趋化因子。研究发现人的CXCL8能促进炎性反应进程、刺激血管的发生、调节宿主免疫功能等,在天然免疫中CXCL8通过与其受体CXCR1结合发挥趋化作用。本研究从海七鳃鳗和东北七鳃鳗中发现并鉴定出与其他物种具有同源性的CXCL8,分别命名为PmCXCL8和LmCXCL8,其受体CXCR1,分别命名为PmCXCR1和LmCXCR1。在此基础上,调查了LmCXCL8和LmCXCR1在东北七鳃鳗体内的表达情况,摸索了LmCXCL8蛋白的原核表达情况,并利用其重组蛋白验证了其趋化功能。最后利用钙流实验,进一步验证了LmCXCL8与LmCXCR1受体的相互关系。首先我们克隆了海七鳃鳗的CXCL8基因(Pmcxcl8),其开放阅读框(open reading frame,ORF)为309 nt,该基因编码102个氨基酸,分子量为11.23 kDa,等电点为9.37,最大疏水指数为4.500,最小疏水指数为-4.500。PmCXCL8氨基酸序列中保守的C36和C38之间插入一个氨基酸残基,为CXC型趋化因子,而且不含ELR(Gly-Gly-Arg)基序,相应位置被GGR(Gly-Gly-Arg)所替代。原核表达对比发现,该蛋白在E.coli Rosetta(DE3)中的表达优于E.coli BL21,最后通过亲和层析法纯化得到了高纯度的PmCXCL8重组蛋白。SDS-PAGE电泳检测和Western blot鉴定结果条带单一,分子量正确,表明我们已成功表达出可溶性良好的PmCXCL8重组蛋白,这为该蛋白功能的研究与抗体的制备提供了实验材料,也为七鳃鳗天然免疫系统进化的研究奠定了基础。在此基础上,我们又克隆了东北七鳃鳗的CXCL8基因(Lmcxcl8),其cDNA全长为1055 nt,包含长为142 nt的5’-非翻译区与长为604 nt的3’-非翻译区,以及309 nt的开放阅读框(ORF),编码102个氨基酸,蛋白结构分析发现在CXC结构前为GGR基序,而非典型的ELR基序。Q-PCR检测发现,LmCXCL8在东北七鳃鳗中属于组成型表达,在鳃、肠、肾、SN等免疫器官里有较高的表达,且能被铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)刺激诱导表达,证明LmCXCL8参与东北七鳃鳗天然免疫反应。通过细胞迁移实验发现重组蛋白LmCXCL8对东北七鳃鳗外周血白细胞有明显的趋化作用,而PBS阴性对照及阻断抗体都没有趋化反应,证明LmCXCL8具有特异性的趋化作用。我们的结果表明,首次发现了在无颌类脊椎动物中由自身的趋化因子引起的趋化反应。接着,我们克隆了海七鳃鳗和东北七鳃鳗的受体Pmcxcr1和Lmcxcr1基因,它们的ORF开放阅读框均为1088 nt,编码360个氨基酸,LmCXCR1与PmCXCR1氨基酸序列一致性分别为95.83%,为七次跨膜蛋白。Q-PCR检测发现LmCXCR1在东北七鳃鳗中属于组成型表达,在免疫器官里有较高的表达,且能被铜绿假单胞菌刺激诱导表达,证明LmCXCR1参与东北七鳃鳗天然免疫反应。通过LmCXCR1受体在HEK293T细胞上表达,经钙流实验初步验证了东北七鳃鳗的CXCR1可能为CXCL8的受体。本课题为探索CXCL8与其可能的受体CXCR1的功能和进化提供了有力依据,同时为进一步研究天然免疫的进化提供了参考。
[Abstract]:A CXCL8 gene ( Pmcxcl8 ) , which has homology to other species , has been identified and identified in E . coli Rosetta ( DE3 ) . In this paper , we found that LmCXCL8 is a constitutive expression in Lampetra japonica . The results show that LmCXCL8 is a constitutive expression in the immune organs such as gill , intestine , kidney , SN and so on .
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4

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