LIMK1基因稳定转染骨肉瘤耐药细胞系的建立及其增殖侵袭能力的研究

发布时间：2018-05-28 11:35

  本文选题：骨肉瘤 + 多药耐药　； 参考：《吉林大学》2016年硕士论文

【摘要】：目的:建立LIMK1激酶活性上调及下调的稳定转染骨肉瘤耐药细胞MG6/VCR细胞系,对比分析细胞增殖、侵袭等生物学特性的改变,为明确LIMK1在骨肉瘤耐药细胞中的调控作用奠定基础。方法:1.在MG63细胞中加入长春新碱,初始浓度为500ng/ml冲击,使骨肉瘤细胞MG63能在含长春新碱(500ng/ml)的培养基中稳定生长,整个诱导过程将耗费时间大约6个月。最终获得能在含有500ng/ml浓度长春新碱的培养液中稳定生长的骨肉瘤耐药细胞,将其命名为MG63/VCR。以后将其在含有长春新碱终浓度为100ng/ml的培养液培养,以维持耐药株的表型,计算MG63、MG63/VCR细胞对常见化疗药物的半数抑制率和耐药指数。2.建立LIMK1基因稳定转染MG6/VCR细胞系。通过G418筛选实验来确定G418最筛选浓度;应用阳离子脂质体介导的方法,将含有LIMK1激酶活性上调、下调及空载体的重组质粒转染进入骨肉瘤耐药细胞MG6/VCR中,经G418加压筛选,得到稳定LIMK1激酶活性上调的骨肉瘤耐药细胞株(命名为CFP-LIMK1-WT,以下简称为上调组)、LIMK1激酶活性下调的骨肉瘤耐药细胞株(命名为YFPLIMK1-DA,以下简称为下调组)及空载表达LIMK1基因的骨肉瘤耐药细胞株(命名为MG63/VCR-E,以下简称为空载体组)。并通过q RT-PCR测定转染效率,免疫沉降、Western Blot实验验证激酶活性,以确保获得稳定转染的细胞株。3.观察稳转后细胞形态改变,并进行细胞增殖、细胞迁移、细胞周期、细胞粘附等生物学特性实验研究。用CCK-8法绘制生长曲线,研究对比稳定转染前后各组细胞增殖能力的差异。通过细胞划痕实验检测三组细胞的体外侵袭能力的变化、流式细胞仪检测细胞周期变化、ELISA法检测人纤维黏连蛋白检测、通过细胞-基质粘附实验观察各组细胞粘附能力的差异。结果:1.骨肉瘤多药耐药细胞MG63/VCR对长春新碱有较高耐受,且显示为中度耐药细胞。同样对紫杉醇、吡柔比星也呈现较高程度的交叉耐药,其耐药指数分别为377.67、32.85,而对耐药指数为1.2的吉西他滨不敏感。说明构建的骨肉瘤耐药细胞MG63/VCR是中度耐药细胞,同时具有多药耐药的特性。2.进行G418浓度筛选实验,筛选浓度在400μg/ml细胞全部死亡,并以此浓度作为后续筛选单克隆的作用浓度。3.q RT-PCR检测上调组、下调组和空载组细胞转染效率。通过与MG6/VCR细胞组进行对照,上调组及下调组细胞LIMK1基因表达明显升高(P0.05)而空载组则无显著性差异(P0.05)。4.免疫沉降及Western Blot实验检测转染后LIMK1蛋白及活性变化。结果显示:与MG6/VCR细胞组相比,上调组及下调组细胞LIMK1蛋白表达明显升高(P0.05);上调组活性明显增强,下调组活性明显降低;而空载组蛋白表达及活性则差异无显著性(P0.05)。5.CCK-8法实验结果示证明了骨肉瘤耐药细胞MG-63/VCR的IC50值为450.4±36.4,耐药指数为390.63是中度耐药细胞,同时具有多药耐药的特性。七天生长曲线图显示与MG63/VCR细胞组相比上调组细胞较MG63/VCR细胞生长迅速,而下调组细胞的体外增殖能力降低(P0.05)。6.划痕实验结果显示上调组比MG63/VCR组具有明显的促进迁移作用;而下调组则能够有效降低MG63/VCR的迁移(P0.05)。7.细胞周期实验结果显示下调组G0/G1期细胞的比例增高(55.637±1.24),上调组细胞G0/G1期细胞的比例降低(42.535±1.07),空载体组和MG63/VCR组G0/G1期细胞的比例分别为46.183±1.13%和46.564±1.23,无明显差别;分裂期细胞比例MG63/VCR组为39.593±1.21,下调组则下降(31.908±1.33,上调组增加(42.671±0.93),进一步证明下调组抑制细胞分裂增殖,上调组促进细胞分裂增殖(P0.05)。8.细胞-基质粘附实验结果显示与对照组相比较,下调组粘附能力明显增强,上调组粘附能力明显减弱,空载组未见明显差异(P0.05)。同时应用ELISA法检测各组细胞人纤维连接蛋白FN表达,结果显示:下调组细胞的FN增高,上调组细胞的FN表达降低,进一步说明了各组细胞粘附能力的差异(P0.05)。结论:1.成功建立了稳定转染LIMK1激酶活性上调、下调、空载表达的三类骨肉瘤耐药细胞系,为后续基因调控的实验提供了新的细胞模型。2.LIMK1激酶活对MG63/VCR细胞的增殖、迁移、粘附及侵袭能力等生物学特性就要有重要的调控作用。
[Abstract]:Objective : To establish a stable and down - regulated MG6 / VCR cell line of osteosarcoma cell line MG6 / VCR , which can stably grow in culture medium containing vinblastine ( 500 ng / ml ) . The cell line of osteosarcoma cell line MG63 and MG63 / VCR was stably transfected into osteosarcoma cell line MG6 / VCR . The results showed that the IC50 values of MG63 / VCR and MG63 / VCR were significantly higher than those in MG6 / VCR cells ( P0.05 ) . Down - regulation and no - load expression of three kinds of osteosarcoma - resistant cell lines provide a new cell model for the subsequent gene regulation experiments . 2 . The biological characteristics of the proliferation , migration , adhesion and invasion ability of MG63 / VCR cells are important to regulate the proliferation , migration , adhesion and invasion ability of MG63 / VCR cells .
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R738

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本文编号：1946552