青蒿AaCMK、AaMCT、AaMCS基因的克隆与功能分析

发布时间：2018-06-05 22:33

本文选题：青蒿 + 2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶　；参考：《西南大学》2016年硕士论文

【摘要】：青蒿素(Artemisinin)是从青蒿(Artemisia annua L.)中提取的一种具有独特过氧桥结构的倍半萜内酯。青蒿素联合疗法(ACTs)是世界卫生组织推荐治疗疟疾的首选方法。此外青蒿素衍生物对治疗病毒感染、癌症、免疫疾病也有重要的药用价值。然而,青蒿中青蒿素含量很低(约0.01%-0.8%),青蒿素分子结构较为复杂,很难采用全化学合成的方法生产青蒿素。因而克隆青蒿素前体合成途径上的基因,为青蒿素代谢工程提供候选基因和作用靶点就十分必要。MEP途径定位于植物细胞的质体中,为包括青蒿素在内的萜类合成提供基本前体物质异戊烯焦磷酸(IPP)和其同分异构体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(MCT)、4-磷酸胞苷-2-甲基赤藓糖激酶(CMK)、2-甲基赤藓糖-2,4-环二磷酸合成酶(MCS)分别是MEP途径的第三、第四、第五个关键酶。MCT催化2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(MEP)生成4-(5′-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇(CDP-ME);CMK催化CDP-ME合成4-(5′-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇-2-磷酸(CDP-ME-2P);MCS催化CDP-ME-2P生成2-甲基赤藓糖-2,4-环二磷酸(ME-cPP)。本文首次克隆了青蒿MCT基因全长cDNA(AaMCT)、CMK基因全长cDNA(AaCMK)、MCS基因全长cDNA(AaMCS)并进行了相关生物信息学分析。AaMCT的cDNA全长1176 bp(GenBank登录号:KU365210),包含906 bp的开放阅读框,编码302个氨基酸。AaCMK的cDNA全长1462 bp(GenBank登录号:KT778821),包含1197 bp的开放阅读框,编码399个氨基酸。AaMCS的cDNA全长811 bp(GenBank登录号:KT725782),包含678 bp的开放阅读框,编码226个氨基酸。基因表达结果表明:AaMCT、AaCMK、AaMCS在青蒿分泌型腺体中大量表达,在叶、花、茎和根中少量表达;同时发现,AaMCT、AaCMK、AaMCS受到MeJA和SA诱导表达,MeJA处理后AaMCT、AaCMK、AaMCS基因的表达量呈极显著提高(P0.01),SA处理后AaMCT和AaCMK基因的表达量呈显著提高(P0.05)。亚细胞定位结果显示:AaMCT、AaCMK、AaMCS分别融合GFP都特异性定位在叶绿体中,这与MEP途径定位于质体这一事实吻合。最后,在拟南芥中分别超量表达AaMCT、AaCMK、AaMCS基因,拟南芥中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量都得到显著提高(P0.01)。转AaMCT基因拟南芥三个株系的叶绿素a含量与对照相比分别提高了22.09%、16.60%、21.05%;转AaMCT基因拟南芥三个株系的叶绿素b含量与对照相比分别提高了23.70%、18.00%、17.43%;转AaMCT基因拟南芥三个株系的类胡萝卜素含量与对照相比分别提高了18.60%、11.53%、21.45%。转AaCMK基因拟南芥三个株系的叶绿素a含量与对照相比分别提高了23.83%、22.27%、18.26%;转AaCMK基因拟南芥三个株系的叶绿素b含量与对照相比分别提高了27.21%、22.79%、18.38%;转AaCMK基因拟南芥三个株系的类胡萝卜素含量与对照相比分别提高了25.24%、16.50%、15.53%。转AaMCS基因拟南芥三个株系的叶绿素a含量与对照相比分别提高了16.04%、12.69%、21.38%;转AaMCS基因拟南芥三个株系的叶绿素b含量与对照相比分别提高了16.18%、16.18%、20.59%;转AaMCS基因拟南芥三个株系的类胡萝卜素含量与对照相比分别提高了11.65%、10.68%、16.50%。表明AaMCT、AaCMK、AaMCS在萜类物质的生物合成中起重要作用。
[Abstract]:Artemisinin ( Artemisinin ) is one of the most preferred methods for the treatment of malaria by Artemisinin . The artemisinin combination therapy ( ACTs ) is the preferred method recommended by the World Health Organization for the treatment of malaria . The contents of chlorophyll a , chlorophyll b and carotenoid in Arabidopsis thaliana were increased by 23.83 % , 16.60 % and 21.38 % , respectively . The contents of chlorophyll a in three lines of AaCMK gene were increased by 16.04 % , 16.18 % and 21.38 % , respectively . The contents of chlorophyll a in three lines of AaCMK gene were increased by 16.04 % , 16.18 % and 21.38 % , respectively .
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2

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