紫球藻Lhc基因的克隆及其生物信息学和表达分析

发布时间：2018-06-07 23:04

  本文选题：紫球藻 + 基因克隆　； 参考：《辽宁师范大学》2016年硕士论文

【摘要】：紫球藻(Porphyridium purpureum)是一种单细胞藻,属红藻门,能合成多种生理和功能独特的活性物质,如藻红蛋白和胞外多糖等。对其所含生理活性物质的研究已成为藻类研究领域的热点之一。本文从五个方面对其进行了研究,结果如下:(1)6条PpLhc基因cDNA全长克隆。在紫球藻基因组文库(http://cyanophora.rutgers.edu/porphyridium/)中筛选得到6条与已知物种Lhc DNA序列相似度达60%以上的基因序列。设计引物并克隆得到6条PpLhc基因,命名为:PpLhc1~PpLhc6。测序结果显示:6条PpLhc基因cDNA全长在701~787 bp之间,开放阅读框在582~672 bp之间,可编码193~223个氨基酸。(2)6条PpLhc基因的生物信息学分析。对6条PpLhc基因及其编码的蛋白质序列进行相关的生物信息学分析,结果显示,PpLHC1蛋白在基本理化性质上与其它PpLHC明显不同;PpLHC5蛋白在跨膜结构域上与其它PpLHC存在显著差异等。同源建模结果显示,6条PpLHC多肽链的二级结构主要以无规则卷曲和α-螺旋为主。亲缘关系分析结果表明,紫球藻LHC蛋白不能与高等植物LHC蛋白的任何一类聚类,与其它藻类LHC蛋白亲缘关系也不相近,因此在进化地位上具有一定独立性。(3)通过实时定量PCR,研究PpLhc基因受光诱导的差异表达情况。实验结果显示,高光强会降低该基因的mRNA表达水平。但6条基因的mRNA表达变化量不同,这可能与其在光合作用中所起作用不同有关。(4)PpLhc1和PpLhc4基因的原核表达。将PpLhc1和PpLhc4基因的ORF序列与表达载体Pcold连接,构建原核表达载体,将其转入大肠杆菌表达菌株Rosetta进行高效表达,提取得到PpLHC1和PpLHC4的包涵体蛋白。经SDS-PAGE电泳后显示PpLHC1和PpLHC4分子量分别约为24 KDa和26KDa,与预测的蛋白质分子量相吻合。该结果为今后制备抗体和体外色素结合实验等研究奠定了基础。(5)菌藻共生体系分析。为探索紫球藻与菌类的共生关系,从紫球藻的菌藻共生培养液中分离纯化出1株细菌,经鉴定为印度洋斯塔普氏菌(Stappia indica)。以无菌紫球藻作为对照组,研究斯塔普氏菌对紫球藻生长的影响,发现该菌株能促进紫球藻的生长和光合作用。
[Abstract]:Porphyridium purpureum is a single-celled algae, belonging to red algae, which can synthesize a variety of physiological and functional active substances, such as phycoerythrin and extracellular polysaccharides. The study of its physiological active substances has become one of the hot spots in the field of algae research. The results are as follows: 1. 6 full-length cDNA clones of PpLhc gene. Six genes with a similarity of more than 60% to the LHC DNA sequences of known species were screened from the genome library http: r / r cyanophora.rutgers.edur / porphyridium / r. Six PpLhc genes were designed and cloned, named as: PpLhc1 and PpLhc6. The sequencing results showed that the cDNA length of 6 ppLhc genes was between 701 and 787 BP, and the open reading frame was between 582 and 672 BP, which could be used for bioinformatics analysis of 6 PpLhc genes encoding 193-223 amino acids. The bioinformatics analysis of six PpLhc genes and their encoded protein sequences showed that the PpLHC1 protein was significantly different from other PpLHCs in the basic physical and chemical properties of PpLHC and other PpLHCs in the transmembrane domain, and there was a significant difference between PpLHC1 protein and other PpLHCs in the transmembrane domain. The homologous modeling results showed that the secondary structures of six PpLHC polypeptide chains were mainly irregular crimp and 伪 -helix. The results of phylogenetic analysis showed that the LHC protein of Porphyra could not be clustered with any of the LHC proteins of higher plants, nor was it closely related to other algae LHC proteins. Therefore, PpLhc gene is independent in evolutionary status.) the differential expression of PpLhc gene induced by light was studied by real-time quantitative PCRs. The results showed that high light intensity could decrease the mRNA expression level of the gene. However, the mRNA expression of the six genes varied, which may be related to the prokaryotic expression of PpLhc1 and PpLhc4 genes. The ORF sequences of PpLhc1 and PpLhc4 genes were linked with the expression vector Pcold, and the prokaryotic expression vector was constructed. The recombinant plasmid was transferred into E. coli strain Rosetta for high expression. The inclusion body proteins of PpLHC1 and PpLHC4 were extracted. SDS-PAGE electrophoresis showed that the molecular weights of PpLHC1 and PpLHC4 were about 24KDa and 26KDarespectively, which were consistent with the predicted molecular weight of protein. The results laid a foundation for the preparation of antibodies and in vitro pigment binding experiments. In order to explore the symbiotic relationship between Porphyridium sinensis and bacteria, a bacterium was isolated and purified from the symbiotic culture medium of Porphyra sp., and identified as Stappia indica (Stappia indica) from the Indian Ocean. The effect of Stapsiella sp. On the growth of Porphyra was studied in the control group. It was found that the strain could promote the growth and photosynthesis of Porphyra.
【学位授予单位】：辽宁师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2

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本文编号：1993184