中华绒螯蟹DDX家族及相关基因对配子发生和卵黄蛋白原表达调控机制的研究

发布时间：2018-06-09 12:07

  本文选题：中华绒螯蟹 + 配子发生　； 参考：《华东师范大学》2016年博士论文

【摘要】：中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)又名河蟹,是我国重要水产养殖物种,与哺乳动物相比,中华绒螯蟹需要更加复杂的环境来诱导其交配、排卵,因此中华绒螯蟹具有独特的生殖调控机制。在水产养殖过程中,中华绒螯蟹的性早熟现象常会给生产带来重大经济损失。因此,探究中华绒螯蟹配子发生的分子调控机制不仅可以为阐明中华绒螯蟹生殖发育提供依据,丰富无脊椎动物生殖发育调控内容,而且可以为中华绒螯蟹水产养殖提供理论指导。配子中RNA的作用主要是调控配子的正常形成、维持配子功能及在受精和胚胎形成过程中发挥作用。RNA的功能主要依赖于它的结构,特别是RNA的二级和三级结构,是RNA行使其功能的最关键因素。DEAD-box家族基因是一类ATP依赖的RNA解旋酶,可以利用ATP水解释放的能量有效修复错误折叠的RNA结构,保证RNA的正确折叠,其参与了RNA代谢的几乎全部过程,包括RNA的转录调控、RNA前体的剪切、核糖体的生物合成、RNA的核输出、翻译的起始、细胞器RNA的代谢、RNA的降解和储存等。因此,该家族基因与配子发生具有密切关系。此外,卵黄发生是甲壳动物卵母细胞成熟的必要条件,是卵巢发育的关键,直接影响甲壳动物的繁殖力及后代幼体的数量和质量,卵黄发生主要是卵黄蛋白原VTG的合成和摄取,因此,本研究主要探究DEAD-box家族及相关基因对配子发生和VTG表达的调控机制。主要内容包括：(1)中华绒螯蟹配子发生相关基因DDX6在mRNA和蛋白水平表达的组织差异性、性腺发育特异性及亚细胞水平分布分析；(2)中华绒螯蟹精子发生相关基因DDX52在mRNA和蛋白水平表达的组织差异、性腺发育过程特异性及亚细胞水平分布分析；(3)FOXL2基因对中华绒螯蟹卵巢成熟时期卵黄蛋白原VTG表达的调控。主要结果如下：1.根据已经获得的中华绒螯蟹精巢和副性腺转录组数据,通过PCR和RACE PCR克隆获得调控配子发生相关基因DDX6、DDX52、FOXL2和FTZ-F1的cDNA全长序列以及DDX20 cDNA部分序列(DDX6 cDNA全长1799bp, ORF 1536bp,编码512个氨基酸；FOXL2 cDNA全长1336bp, ORF 1050bp,编码349个氨基酸；FTZ-F1 ORF 1512 bp,编码504个氨基酸；DDX52 cDNA全长2225bp, ORF 1635bp,编码544个氨基酸；已获得的DDX20序列1440bp,编码479个氨基酸)。2.应用qRT-PCR、western blot和IHC技术分析DDX6 mRNA和蛋白水平表达模式和分布。发现DDX6 mRNA在精巢和卵巢中表达量较高,在其他组织中表达量均较低；在精巢发育过程中,DDX6 mRNA表达量从7月开始逐渐增加,在10月达到最高,然后逐渐降低；在卵巢发育过程中,DDX6 mRNA表达量在初级卵母细胞生长期明显高于成熟前期。DDX6蛋白在精巢和卵巢中均有表达,精巢中主要分布在精原细胞和初级精母细胞的细胞质中,精细胞中分布较少；卵巢中主要分布在卵母细胞的细胞质中。3.应用qRT-PCR、ISH、western blot和IF技术分析DDX52 mRNA和蛋白水平表达模式和分布。发现DDX52 mRNA在卵巢、副性腺和精巢中表达量较高,在血淋巴、心、肌肉、胃和胸神经节中表达量较低；在精巢发育过程中,DDX52 mRNA表达量在8月和次年1月最高；DDX52 mRNA主要分布在精原细胞的细胞核中；在精母细胞期,几乎检测不到DDX52 mRNA的表达；在精子形成时期,DDX52 mRNA主要分布在精细胞的细胞核中,少量分布在后期精细胞的顶体帽和顶体管中。DDX52蛋白在肌肉、副性腺、卵巢、心、鳃和精巢中均有表达,其中在精巢中表达量最高；与mRNA表达模式一致,DDX52蛋白表达量在8月精细胞期达到最高；在精巢发育过程中,DDX52蛋白主要分布在精子发生早期精原细胞的细胞质中,精子形成早期和中期精细胞的细胞核中；精子形成后期精细胞的前顶体囊中。4.qRT-PCR和western blot结果显示DDX20、FOXL2和FTZ-F1 mRNA和蛋白均在卵巢组织中表达量最高；在卵巢发育成熟期,JOXL2、DDX20和FTZ-F1 mRNA水平逐渐上升,而VTG mRNA水平逐渐降低；随着凋亡诱导剂Etoposide注射浓度的增加,滤泡细胞中FOXL2和DDX20 mRNA和蛋白水平表达量有上升趋势；并且CO-IP证明FOXL2与DDX20蛋白间的相互作用；此外,随着摘除单侧眼柄处理时间的增加,FOXL2、DDX20、FTZ-F1和FTG mRNA表达水平逐渐上升,并且FOXL2、DDX20和FTZ-F1 mRNA具有相同的表达模式；最后CO-IP证明FOXL2通过其forkhead domain与FTZ-F1蛋白相互作用。综上所述,本研究应用qRT-PCR, IF, IHC, western blot和CO-IP等技术研究了中华绒螯蟹中调控生殖的相关基因,其中DDX6参与调控配子发生过程,主要调控卵母细胞的生长；DDX52参与调控精子发生过程中有丝分裂和精子形成,可能在后续精卵融合和胚胎早期发育过程中发挥重要作用；在卵巢发育成熟时期,FOXL2一方面与DDX20相结合调控滤泡细胞的凋亡,阻止卵母细胞通过滤泡细胞从血淋巴中吸取VTG,另一方面,FOXL2与FTZ-F1相结合可能参与调控P450芳香化酶的表达,调控类固醇激素的合成,控制肝胰腺释放VTG。
[Abstract]:In this study , it is important to study the mechanism of RNA interference . In addition , the mechanism of RNA interference is mainly dependent on its structure , especially the secondary and tertiary structure of RNA .
( 2 ) The expression of DDX52 gene DDX52 mRNA and protein level in the spermary of the crab crab , the specificity of the sex gland development and the analysis of sub - cell level distribution ;
( 3 ) The main results were as follows : 1 . The cDNA full - length cDNA sequence of DDX6 , DDX52 , FoxL2 and FTZ - F1 was obtained by PCR and RACE PCR cloning , and the full length of DDX6 cDNA was 1799bp , ORF 1536bp and 512 amino acids were encoded by PCR and RACE PCR .
The total length of FoxL2 cDNA is 1336bp , ORF is 1050bp , and 349 amino acids are encoded .
FTZ - F1 ORF 1512 bp encoding 504 amino acids ;
The cDNA length of DDX52 cDNA is 2225bp , ORF 1635bp and encodes 544 amino acids .
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本文编号：1999672