SLC15A4基因单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮的关联性研究

发布时间：2018-06-13 16:44

本文选题：系统性红斑狼疮 + 单核苷酸多态性　；参考：《第三军医大学》2016年博士论文

【摘要】：系统性红斑狼疮(SLE)是一种伴有多器官损害的系统性自身免疫性疾病,由异常活化的T细胞和B细胞导致自身抗体的高表达以及对自身抗原的免疫耐受失调。SLE的病因到目前为止仍然不是十分清楚,已知的因素包括基因水平的改变、表观遗传学的调控以及环境和激素等相互影响。近几年来,在基因的水平上对SLE的病因研究有了很大的进展,研究者们通过候选基因分析以及全基因组关联研究(genome-wide association studies GWASs)等方法已经确认了超过40个SLE的易感基因。基因SLC15A4 (solute carrier family 15, member 4)属于质子偶联组氨酸及寡肽转运体家族,它含有12个跨膜结构域且能够将组氨酸及寡肽从溶酶体内部转运至胞浆,包括L-丙氨酸-g-D-谷氨酸-内消旋二氨基庚二酸多肽(L-Ala-g-D-Glu-meso-diaminopimelic Acid, tri-DAP),核苷酸结合寡聚化学结构域-1(nucleotide oligomerization domain-1, NOD1)配体和肌肽。SLC15A4最常见的表达部位是大脑和免疫细胞,尤其是浆细胞样树突状细胞。既往的研究者们对SLC15A4基因突变或缺失的老鼠模型的研究,发现SLC15A4基因的缺失会导致NOD1,Toll样受体7 (TLR7)和Toll样受体9 (TLR9)依赖的细胞因子如Ⅰ型干扰素的表达下降,而这些受体及细胞因子在SLE的发病机制中起着非常关键的作用。此外,在红斑狼疮的小鼠模型中发现SLC15A4的缺乏会减少B细胞中自身抗体的产生,并且其对包括抗DNA抗体和抗小核核糖核蛋白(anti-snRNP)在内的IgG2a和IgG2c类自身抗体的产生非常关键。最近的研究也表明,SLC15A4参与维持内体pH值的稳定以及在固有免疫中被TLR7,TLR9,NOD1和NOD2所激活的通路中起非常关键的作用。在一项关于SLC15A4缺失的小鼠模型的研究,证明小鼠体内的浆细胞样树突细胞的功能受损并且导致了其慢性病毒性感染。最近一个研究小组发现在狼疮小鼠模型的B细胞中SLC15A4对于由TLR7信号通路所所激活产生的IFN-Ⅰ和自身抗体的分泌起着关键性的作用,SLC15A4的缺失能够使内溶酶体的pH值紊乱,并且可能是通过改变v-ATP酶的完整性来实现这一结果,而这些改变又可以使哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路失调,最终导致 IFN 调节因子 7 (IFN regulatory factor 7,IRF7) -IFN-Ⅰ调节回路的紊乱。在这个调控回路中,SLC15A4转运体的活化程度在对于由TLR触发的信号通路中细胞因子的产生中占有这不可或缺的地位,整个研究揭示了被SLC15A4所调控的内溶酶体环境的完整性在TLR7激发的信号通路中的重要性,以及其对于依赖于mTOR信号通路的IRF7-IFN-Ⅰ调节回路所分泌自身抗体的影响。既往的GWAS研究已经发现在韩国人和中国人中间,SLC15A4是一个与红斑狼疮发病相关的位点。2009年的一个关于中国汉族的GWAS研究第一次报道SLC15A4是SLE的的易感基因,研究者们检测出2个SNPs (rs10847697, rs1385374)位点在SLE患者与对照组之间有显著性的差异。随后,另一个研究小组对其中一个SNP(rs10847697)位点进行了基因型-表形的分析,发现其在患有盘状红斑狼疮的SLE患者中的表达显著高于无盘状红斑狼疮的患者。在高加索人群中的研究发现,SLA15A4的2个SNPs(rs10847697,rs1385374)的水平与SLE患者狼疮肾的发病有很强的关联性。总的来说,大量的研究都表明,SLC15A4基因多态性在SLE的发病机制中起着关键性的作用。在本研究中,我们通过收集中国西南部地区汉族人口中的355例SLE患者以及375例健康者的外周血,对SLC15A4的基因多态性与SLE的关系进行了相关性分析。我们主要集中在SLC15A4中18个SNP位点的等位基因和基因型在SLE与健康者中的表达差异,相关SNP位点与SLE的主要临床表现相关性分析,以及18个SNP之间的连锁不平衡分析,最后我们对SLC15A4基因在外周血中mRNA及蛋白的表达进行了分析。目的:既往的研究已经报道SLC15A4在SLE的发病机制中起着关键性的作用,本课题为了研究SLC15A4基因多态性与SLE易感性之间的关联,通过比较355名SLE患者与375名健康对照者中SLC15A4基因18个SNP位点的等位基因频率和基因型以及相应遗传模型的分布差异,分析各个位点的基因频率以及遗传模型与SLE的易感性关系,并构建18个SNP位点的单体型分析与SLE的关联,结合患者临床信息,分析各存在显著差异的位点与疾病表型间的关联性。最后检测SLC15A4基因mRNA及蛋白表达差异,期望为SLE提供新的潜在的治疗靶点。方法:1.本研究采用病例对照研究的方法,分别对355例诊断明确的SLE患者与375例健康对照者进行了分析,所有的病例均来源于从2008年1月到2013年3月期间就诊于重庆市第三军医大学西南医院皮肤科且诊断明确的SLE患者,所有患者均达到1997年美国风湿病学会(American College of Rheumatology)修订的SLE分类标准并且排除其他系统性或自身免疫病。健康对照组均来自于该院健康体检中心,对照者均无重大疾病且无任何SLE分类标准中的一项。在选取的18个SNP位点中对其中16个采用基质辅助激光解析电力飞行时间质谱技术(MSLDI-TOF MS)检测其等位基因频率及基因型在患者组和对照组之间的差别。剩余两个SNP位点(rs7965732, rs3765108)则采用TaqMan杂交法在罗氏LightCycler480实时荧光定量PCR系统中进行基因频率及基因型检测。病例组及对照组均用卡方检验进行哈迪-温伯格平衡检验(Hardy-Weinberg equilibrium test),等位基因频率、基因型频率以及单体型频率分析均采用卡方检验和logistic回归模型完成,连锁不平衡的构建及差异分析应用Haploview软件及logistic回归完成,所有数据分析均使用SPSS17.0版完成,P0.05被认为存在统计学差异。2.检测SLC15A4基因mRNA及蛋白在SLE患者及健康对照之间的表达:选取15名诊断明确的SLE患者,所有患者均符合ACR分类标准,选取10名健康对照,均无其他重大疾病及ACR分类标准中任何一项。采用实时荧光定量PCR和免疫印记法,在PBMC中分别对SLC15A4基因mRNA及蛋白表达进行了检测,实验数据使用SPSS 17.0软件进行统计分析,P0.05为存在统计学差异。主要结果:1.SLC15A4基因多态性的等位基因频率分布:在本次研究的18个位点中,其中5个在SLE患者和健康对照之间有显著的差异。下列SNP与增加SLE的发病风险相关:rs959989T(OR=1.317, 95%CI=1.027-1.689), rs1385374T(OR =1.332, 95%CI=1.039-1.707),以及 rs983492T(OR=1.295,95%CI=1.001-1.675)。下列 SNP 与降低 SLE 的发病风险相关:rs12298615G (OR=0.778,95%CI=0.606-0.998)和 rs10847697G (OR=0.770,95%CI= 0.600-0.986)。2.SLC15A4基因多态性的基因型分布频率:我们分别在共显性、显性以及隐性模型下对SLE患者和健康对照者进行基因型的分析。在共显性模型分析中,我们发现位点rs3765108 中的基因型 AG 显著高于基因型 AA(P=0.019,OR=1.447, 95%CI=1.063-1.970),位点rs7308691中的基因型AT分布频率明显高于基因型AA分布频率(P=0.049,OR=1.645, 95%CI=1.000-2.705)。在显性模型中发现位点rs1385374与SLE的发病显著相关(TT+CTvsCC, P=0.042,OR=1.1363,95%CI =1.010-1.840)。3.SLC15A4基因SNP位点与疾病表型的关联分析:①在325例SLE患者中,对阳性体征患者与阴性体征患者进行比较,位点rs959989,rs1385374, rs10847697和rs12298615与SLE患者中盘状红斑的发生存在统计学差异(P0.05),与面部蝶形红斑、口腔溃疡、光敏感、浆膜炎、肾脏异常、关节炎、血液系统异常、神经系统异常、免疫体统异常、抗核抗体均无统计学差异(P0.05);位点rs983492与SLE患者中肾脏异常的发生存在统计学差异(P0.05),与面部蝶形红斑、盘状红斑、口腔溃疡、光敏感、浆膜炎、关节炎、血液系统异常、神经系统异常、免疫体统异常、抗核抗体均无统计学差异(P0.05)。②在阳性体征患者与健康对照组的比较中,位点rs959989,rs1385374,rs983492和rs12298615与SLE患者面部蝶形红斑、盘状红斑、口腔溃疡、光敏感、浆膜炎、关节炎、血液系统异常、肾脏异常、免疫系统异常的发生均存在统计学差异(P0.05),与神经系统异常、抗核抗体无统计学差异(P0.05);位点rs983492与SLE患者面部蝶形红斑、光敏感、浆膜炎、关节炎、血液系统异常、肾脏异常、免疫系统异常、抗核抗体均存在统计学差异(P0.05),与盘状红斑、口腔溃疡、神经系统异常均无统计学差异(P0.05)。③在阴性体征患者与健康对照组的比较中,位点rs959989和rs1385374与面部蝶形红斑、盘状红斑、口腔溃疡、光敏感、浆膜炎、肾脏异常、血液系统异常、神经系统异常、免疫体统异常均存在统计学差异(P0.05),与关节炎、抗核抗体无统计学差异(P0.05);位点rs983492和rs12298615与面部蝶形红斑、盘状红斑、光敏感、浆膜炎、肾脏异常、血液系统异常、神经系统异常、免疫体统异常均存在统计学差异(P0.05),与关节炎、口腔溃疡、抗核抗体无统计学差异(P0.05);位点rs983492与面部蝶形红斑、光敏感、浆膜炎、肾脏异常、血液系统异常、免疫系统异常均存在统计学差异(P0.05),与盘状红斑、口腔溃疡、神经系统异常、抗核抗体均无统计学差异(P0.05)。4.连锁不平衡分析:应用Haploview软件对18个SNP位点进行连锁不平衡分析发现存在2个单体型块。单体型块1长度为1kb并包括以下3个SNPs:rs7965732,rs3765108和rs7308691,单体型块2长度为29kb并包含以下15个SNPs :rs7302634,rs9738216,rs2291350,rs11059915,rs12298615,rs4760592,rs959989,rs959987,rs7311875,rs11059925,rs10847697, rs1385374,rs10847699,rs983492 和 rs1552336。所有频数小于等于5的单体型被整合到一起来简化整个统计分析过程,同时把每个单体型块中出现频数最高的单体型作为与SLE相关性分析的参照模版。在单体型块1中,频率最高的单体型是AAT,其在SLE患者和对照组的频率分别为57.3%和57.2%,其他单体型与其相比较未发现存在明显统计学差异。在单体型块2中,频率最高的单体型是TTTGGCACAAGCTTC,其在SLE患者及健康对照组的比例分别为31.7%和31.5%,其次为单体型CCCGAGTCAAATTTC的频率在SLE与对照组中分别为24.2%和17.4%,其与单体型TTTGGCACAAGCTTC相比较发现在患者中和对照组中存在显著统计学差异(P = 0.033, OR 1.376, 95% CI=1.026-1.845)。5.SLC15A4基因mRNA及蛋白在SLE患者及健康对照之间的表达:与健康对照组相比,SLC15A4基因mRNA表达在SLE患者的PBMC中要显著升高,两组之间存在统计学差异(P0.05),而SLC15A4基因编码的蛋白表达略高于对照组,两组之间无明显统计学差异(P0.05)。主要结论:我们的研究证明 5 个 SNP 位点(rs959989,rs1385374,rs983492,rs12298615,和rs10847697)在SLE中存在显著差异,可能是作为SLE的发病危险因子之一,共显性模型分析揭示SNP位点rs3765108的基因型AG与AT在SLE患者与对照组中存在显著差异,显性模型分析显示位点rs1385374的基因型TT+CT在SLE患者中显著高于基因型CC,疾病表型分析发现盘状红斑及狼疮肾炎与5个SNP位点存在显著相关性,单体型块分析发现单体型CCCGAGTCAAATTTC与SLE的发病相关,SLC15A4基因mRNA及蛋白SLE患者中的表达均高于对照组,因此,SLC15A4基因的单核苷酸多态性与中国汉族人群SLE的发病密切相关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R593.241

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