农杆菌介导多裂叶荆芥转化体系建立及Cjhppd基因导入

发布时间：2018-06-17 11:56

本文选题：多裂叶荆芥(Nepeta + multifida)　；参考：《河北大学》2017年硕士论文

【摘要】：对羟基苯基丙酮酸双加氧酶(ρ-hydroxyphenylpyruvate dioxigenase,HPPD,EC1.13.11.27)是20世纪90年代确定的除草剂靶标酶,在植物体内它可参与生育酚和质体醌的生物合成。Cjhppd是从对除草剂DTP具有抗性的黄连(Coptics japonica)小檗碱高产细胞系中克隆出来的编码黄连HPPD的基因,本试验旨在将Cjhppd基因导入多裂叶荆芥并获得转基因植株,以研究Cjhppd对转基因植物抗性性状改良的作用。为建立根癌农杆菌介导的多裂叶荆芥转化体系,以携带pBI121-gfp质粒的根癌农杆菌LBA4404菌株介导,荆芥试管苗带叶腋茎段为转化受体材料,探究了预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间4个因素对荆芥转化效果的影响。每个因素设置4个水平,以L16(45)正交实验进行,每个实验重复3次。筛选的卡那霉素抗性芽以及植株进行gfp荧光检测和PCR、RT-PCR分子检测。按照上述优化的转化条件,以携带pGWB2-Cjhppd植物表达载体的根癌农杆菌LBA4404菌株介导多裂叶荆芥的Cjhppd基因转化,得到转Cjhppd多裂叶荆芥植株。对转Cjhppd荆芥植株进行PCR、RT-PCR分子检测;用含有不同浓度的DTP和NaCl的Hoagland营养液或MS培养基对多裂叶荆芥转化植株进行胁迫处理,分析转基因植株的除草剂抗性和耐盐性。主要结果如下:1.gfp基因导入转化多裂叶荆芥,并在根茎叶花中表达;转化植株的根中gfp基因表达量最多;其次是茎和叶中,且两者表达量差别不大;花中最少;预培养5 d、菌液浓度为0.7、侵染15 min、共培养3 d为多裂叶荆芥的最优转化条件。转化率为20%,每个外植体再生抗性不定芽数平均为5个;抗性芽生根培养30 d后得到转化植株,生根率为60%。荆芥转化体系的建立为利用植物基因工程改良其遗传性状奠定基础。2.筛选培养30 d后,将转Cjhppd卡那霉素抗性芽生根培养1个月后,得到卡那霉素抗性植株;转化率为22%,每个外植体再生抗性不定芽数平均为5个;转化芽在生根培养基培养12 d后生出第一条根,生根率为66%。3.提取DNA进行PCR检测表明Cjhppd基因整合到多裂叶荆芥基因组上。待转化荆芥植株长到株高5-6 cm将其移栽。经过一个月得到移栽苗,移栽成活率为60%。提取RNA进行RT-PCR检测表明Cjhppd基因在根、茎、叶中都有表达。从转录水平上说明Cjhppd在转基因荆芥基因组中表达。4.对转Cjhppd荆芥植株叶片进行除草剂抗性检测,结果表明:相同DTP浓度下,转化植株白化程度明显弱于野生植株。初步认为,转Cjhppd荆芥对除草剂DTP表现出一定的抗性。5.对转Cjhppd荆芥植株进行盐胁迫处理,转化荆芥在NaCl浓度为150 mmol/L时可以健康的生长,在200 mmol/L为时出现萎蔫;而野生型荆芥植株在50 mmol/L时就出现叶片发黄萎蔫的现象。6.对耐盐性指标测定结果表明:经过不同浓度盐胁迫后,野生型和转化荆芥植株的脯氨酸含量、POD活性、MDA含量、CAT活性都呈现先上升后下降的趋势,转化植株的指标上升值明显低于野生型。野生型植株叶绿素和类胡萝卜素含量下降;转化植株3种光合色素含量先上升后下降,而且在同一盐浓度下含量高于野生型。盐对类胡萝卜素含量影响较大。初步说明转化植株对盐胁迫表现出了一定的抗性,耐受浓度为150mmol/L。类胡萝卜素可能与提高转化植株耐盐性相关。
[Abstract]:The transgenic plants were transformed with Agrobacterium tumefaciens LBA4404 containing different concentrations of DTP and NaCl . The results showed that the content of proline , POD activity , MDA content and CAT activity of transgenic plants showed that the content of proline , POD activity , MDA content and CAT activity of transgenic plants were higher than those of wild plants .
【学位授予单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q943.2

【参考文献】