用于选择性优产雄烯二酮的工业小金色分枝杆菌的基因改造

发布时间：2018-06-25 04:41

  本文选题：甾醇降解 + -雄烯二酮　； 参考：《武汉大学学报(理学版)》2017年01期

【摘要】：工业上用于生产4-雄烯-4-醇-3,17-二酮(4-雄烯二酮,4-AD)的小金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)在降解植物甾醇侧链的过程中同时产生部分1,4-雄烯-4-醇-3,17-二酮(1,4-雄烯二酮,ADD),而3-甾酮-Δ1-脱氢酶KstD催化了4-AD到ADD的转化.克隆该工业菌株的kstD基因测序后发现,其与报道的标准分枝杆菌基因组中的kstD基因相比有3个氨基酸的突变(A6E,S138L,A193V).这些突变使得KstD的酶活受到影响,一定程度上阻碍4-AD向ADD的转变.为了实现从植物甾醇降解中选择性地得到4-AD或ADD,通过敲除kstD基因,阻断4-AD到ADD的转化,获得一株只产4-AD的突变菌株,代谢产物中4-AD达79.3%.通过修复kstD酶的氨基酸位点,使之恢复到文献报道的正常序列,并在敲除kstD基因菌株中,将修复后的kstD基因安置在强启动子pG13下,重新导回到突变菌株中进行回补强化表达,获得一株可以大量产生ADD的菌株.野生型分枝杆菌转化植物甾醇产生的产物中,ADD仅占27.0%,经回补强化表达后的基因工程菌株转化植物甾醇产生的产物中ADD占63.0%.结果表明,通过敲除或者在突变体菌株中过表达正常的kstD基因可以使该工业菌株选择性地优产4-AD或ADD.
[Abstract]:Mycobacterium neoaurum, which is used to produce 4-androgen-4-androstene-17-diketone (4-AD), produces a part of 1O4-androgen-4-ol -317-dione (14-androstenedione add) and 3- sterone-螖 1- desorption while degrading the side chain of phytosterol. KstD catalyzes the conversion of 4-AD to add. After cloning the kstD gene of the industrial strain, it was found that there were three amino acid mutations (A6EN S138LN A193V) between the kstD gene and the reported kstD gene in the standard mycobacterium genome. These mutations affected the enzyme activity of KstD and hindered the conversion of 4-AD to add to some extent. In order to obtain 4-AD or ADD selectively from phytosterol degradation, a mutant strain producing 4-AD was obtained by knockout the kstD gene and blocking the transformation from 4-AD to add. The metabolic product of 4-AD reached 79.3%. By repairing the amino acid site of kstD enzyme, the kstD gene was restored to the normal sequence reported in the literature, and the kstD gene was inserted in the kstD gene knockout strain under the strong promoter pG13. A strain that can produce add in large quantities was obtained. Only 27.0% of the products from phytosterol transformed by wild type Mycobacterium spp., and 63.0% of the product from phytosterol transformed by genetically engineered strain after supplementation and enhanced expression. The results showed that the industrial strain could selectively produce 4-AD or ADD by knockout or overexpression of the normal kstD gene in the mutant strain.
【作者单位】： 武汉大学药学院;
【基金】：国家自然科学基金资助项目(210700039)
【分类号】：Q78

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本文编号：2064624