基于量子点功能化生物传感器的转基因大豆检测研究

发布时间：2018-07-17 21:47

【摘要】：自从第一例转基因大豆成功转化以来,转基因大豆品种和种植面积日渐增加,其安全性及对环境的影响等问题已变成了人们关注的焦点。因此,为了保障消费者的权益,转基因大豆检测已成为转基因研究的必要环节,发展快速、灵敏、高通量、自动化的新型检测方法,已成为国内外转基因产品检测方法的热点,对推进转基因技术发展,保障转基因大豆的安全监管和维护社会稳定具有极其重要的意义。本论文以量子点为信号材料,构建光电、荧光生物传感器,并将其应用于转基因大豆 35S 启动子(Promoter of cauliflower mosaic virus 35s,P35S)或(和)NOS终止子(Terminatomopalinesynthase,TNOS)的检测中,并通过所设计方法之间的比较,选择最优设计方案,结合机器视觉技术开发检测转基因大豆的装置,以达到快速、灵敏、高通量、自动化检测的目的。具体研究内容如下:1、以制备的金纳米粒子-还原氧化石墨烯(Gold nanoparticles-reduce graphene oxide, AuNPs-rGO)纳米功能材料为基底材料,连接带有-SH的DNA探针(probel),制得固定探针;采用静电吸附法将大量的CdTe量子点(Quantum dots,QDs)均匀的负载在SiO2表面,形成核-壳结构SiO2@CdTe纳米球,然后通过酰胺反应与-NH2修饰的DNA探针(probe2)连接,制得捕获探针;固定探针、捕获探针分别与P35S目标DNA的两端特异性杂交,形成“三明治”结构的光电化学生物传感器,应用于转基因大豆中P35S的检测。研究发现,SiO2@CdTe纳米球的光电流信号是CdTe QDs的2.5倍,rGO-AuNPs具有大的比表面积和出色的导电性能,该传感器以核-壳结构的SiO2@CdTe纳米球和rGO-AuNPs纳米复合物作为双重信号放大策略,DNA探针作为识别元件,具有良好的选择性、灵敏度、重现性和稳定性。在优化条件下,P35S的浓度与该传感器的光电流强度呈现良好的正相关性,线性范围为0.1 pM～500 pM,检出限为0.05 pM (S/N=3),并用于实际转基因大豆样品检测,为光电化学传感技术在转基因检测的应用提供了新思路。2、采用常压水热法制备荧光性能优良、表面富含-COOH基团的氮杂石墨烯量子点(Nitrogen-doped graphene quantum dots,NGQDs)作为信号分子,通过酰胺反应与带有-NH2的DNA探针(probel)连接,制得捕获探针;所制备的粒径均匀的银纳米粒子(Silver nanoparticles,AgNPs)通过Ag-S键与带有-SH基团的DNA探针(probe2)结合,制得固定探针;固定探针、捕获探针分别与P35S目标DNA的两端进行特异性杂交,从而拉近NGQDs-AgNPs的距离,促使荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)的发生,构成均相荧光生物传感体系。研究发现,NGQDs的荧光发射光谱和AgNPs的紫外吸收光谱具有大幅重叠的特性,在优化条件下,P35S的浓度与NGQDs的荧光强度呈现良好的负相关性,线性范围为0.1nM～500nM,检出限为0.03nM(S/N=3)。该荧光生物传感体系的检测过程在均相溶液中进行,无需分离,操作步骤简单,且具有良好的选择性和重现性,并成功将其应用于转基因大豆的检测,为转基因检测提供了一种有效途径。3、采用改进的Stober法分别制备SiO2纳米球内部包裹绿色CdTe QDs(green QDs,gQDs)、红色 CdTe QDs (red QDs,rQDs)的核-壳结构 gQDs@SiO2、rQDs@SiO2纳米复合材料,通过静电吸附法在其表面分别吸附大量的gQDs、rQDs,从而得到荧光性能优良的gQDs@SiO2@gQDs、rQDs@SiO2@rQDs荧光微球;制备的荧光微球gQDs@SiO2@gQDs、rQDs@SiO2@rQDs通过酰胺反应分别与-NH2修饰的TNOS捕获探针(CaptureprobesofTNOS,CT)和P35S捕获探针(CaptureprobesofP35S,CP)共价结合,制得 gQDs@SiO2@gQDs-CT 和rQDs@SiO2@rQDs-CP;以具有优良磁性的核-壳型金磁微粒(Fe3O4@Au magnetic beads, MBs)为磁控材料,通过Au-S键分别与修饰-SH的TNOS固定探针(Fixing probes of TNOS, FT)、P35S 固定探针(Fixing probes of P35S,FP)结合,制得MBs-FT 和 MBs-FP; gQDs@SiO2@gQDs-CT、MBs-FT 分别与 TNOS 的两端特异性杂交;rQDs@SiO2@rQDs-CP、MBs-FP分别与P35S的两端特异性杂交;利用MBs的磁性对目标DNA所连接上的荧光微球进行分离,随后检测剩余溶液的荧光强度,构建了磁控生物传感体系。在优化条件下,TNOS和P35S的浓度与所剩溶液中的荧光强度呈现良好的负相关性。线性范围分别为0.2 nM～800 nM和0.1nM～800nM,检出限分别为0.07nM和0.04nM(S/N=3)。成功将构建的磁控生物传感体系用于TNOS和P35S的同时检测,为转基因多目标检测提供了新思路。4、通过控制合成时间,分别制备发射绿色荧光的gQDs和发射红色荧光的rQDs; gQDs、rQDs分别通过酰胺反应与-NH2修饰的TNOS捕获探针(CT)和P35S捕获探针(CP)共价结合,制得gQDs-CT和rQDs-CP纳米生物探针(荧光信号“开”);MWCNTs@GONRs同时作为两种纳米生物探针的荧光淬灭剂,使其荧光同时淬灭(荧光信号“关”);向所构建的传感体系中同时加入目标物TNOS和P35S时,通过目标物和对应的纳米生物探针之间DNA特异性杂交互补配对,形成双链DNA,从而使纳米生物探针从MWCNTs@GONRs表面脱落,发生荧光恢复(荧光信号“开”)。在优化条件下,TNOS和P35S的浓度与荧光强度呈现良好的正相关性。线性范围分别为1.5 nM～1000 nM和1.2 nM～900 nM,检出限分别为0.5 nM和0.35 nM (S/N=3)。该传感体系具有良好的选择性、重现性和稳定性,为转基因多重目标的同时检测奠定了基础。5、通过以上几种转基因检测方法的比较,搭建了基于两种颜色CdTe QDs和机器视觉技术的转基因TNOS和P35S检测装置。采用荧光“开-关-开”效应的生物传感体系对目标物进行显色,通过图像信息采集、图像分割、图像特征数据处理对实验结果进行分析。该方法可以实现对TNOS和P35S的快速检测,而且操作简单、自动化、智能化,省去了繁琐的实验数据处理过程,其准确度高、时效性好,是转基因检测的一个重要突破。
[Abstract]:In order to protect consumers ' rights and interests , the detection of transgenic soybean has become the focus of transgenic research . In this paper , the fluorescence emission spectrum of NGQDs and the fluorescence intensity of NGQDs were studied . The results showed that the fluorescence emission spectrum of NGQDs and the fluorescence intensity of NGQDs showed a good negative correlation . The detection limit of the fluorescence emission spectrum was 0.1nM ~ 500 nM , the detection limit was 0.03 nM ( S / N = 3 ) . The fluorescence intensity of TNOS and P35S capture probes ( fluorescence signal " on " ) was obtained . The results showed that the fluorescence intensity of the fluorescence microballoons was 0.2nM ~ 800 nM and 0.1nM ~ 800 nM , respectively . The detection limits were 0 . 2 nM ~ 800 nM and 0.1 nM ~ 800 nM , respectively . The detection limit was 0 . 07nM and 0 . 04nM ( S / N = 3 ) . The method can realize the rapid detection of TNOS and P35S , and the operation is simple , automatic and intelligent , and the tedious experiment data processing process is saved , the accuracy is high , the timeliness is good , and is an important breakthrough of transgenic detection .
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TP212.3;TS214.2

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