小鼠受精卵模拟微重力差异基因的验证及Ndufa4对其体外发育的影响

发布时间：2018-07-26 19:04

【摘要】：本实验室利用转臂式生物反应器(RWVB)所产生的模拟微重力环境对小鼠受精卵进行体外培养,以平面培养作为对照,观察模拟微重力环境对小鼠受精卵的影响情况。通过单细胞测序发现C57小鼠受精卵在hCG 20h、hCG后20h平面培养9h与hCG后20h微重力培养9h存在7个差异基因。本实验以昆明小鼠为研究对象,通过Q-PCR方法验证这七个差异基因:Tmem59、Teddm1b、1600010M07Rik、Lars2、Ndufa4、Nts和Papolog的相对表达情况,与单细胞测序结果进行比较计算准确率。挑选出差异基因Ndufa4,通过Q-PCR、构建载体、干扰、显微注射等方法研究Ndufa4的功能机制。以hCG 20h为对照组(A组)、继续平面培养9h(D组)、继续微重力培养条件下培养9h(E组)。本实验室党楠楠通过单细胞测序发现:D与E组表达差异1.5倍以上的基因共7个。本实验通过Q-PCR方法在昆明小鼠受精卵对Tmem59、Teddm1b、1600010M07Rik、Lars2、Ndufa4、Nts和Papolog这七个单细胞测序结果验证发现:这七个基因在D组与E组相对表达量显著差异的基因有Lars2、Tmem59、Ndufa4和1600010M07Rik;D组与E组相对表达量显著不差异的基因为Papolg与Nts;而Teddm1b基因则由于表达量过低未检测出。单细胞测序结果验证结果准确率为66.7%。初步筛选出Ndufa4基因,以hCG后20 h时雌雄原核均出现的状态作为受精标志,构建Ndufa4的表达载体与干扰SiRNA,通过显微注射观察对受精卵的发育影响。结果显示:显微注射后小鼠受精卵囊胚率显著降低。以hCG 20h后显微注射水为对照,显微注射pEGFP-Ndufa4表达载体为实验组,通过Q-PCR检测Bcl家族Bax、Bak、Bcl-xl和Bcl-2基因(其中Bax、Bak为促凋亡基因,Bcl-xl与Bcl-2为抑凋亡基因)的相对表达量。结果表明:过表达Ndufa4基因会使小鼠Bax与Bak显著升高;引起细胞线粒体凋亡的蛋白cyt C的相对表达量也显著升高。以hCG 20h后显微注射水为对照,显微注射Ndufa4的SiRNA为实验组,通过Q-PCR检测Bcl家族Bax、Bak、Bcl-xl和Bcl-2基因(其中Bax、Bak为促凋亡基因,Bcl-xl与Bcl-2为抑凋亡基因)的相对表达量。结果表明:干扰小鼠Ndufa4基因的表达会导致Bax的相对表达量显著升高;cytC的相对表达量也显著升高。Ndufa4的过表达或者干扰均可能会影响凋亡因子的表达,最终导致受精卵凋亡。
[Abstract]:In our laboratory, the simulated microgravity environment produced by (RWVB) was used to culture mouse fertilized eggs in vitro, and the effect of simulated microgravity environment on mouse fertilized eggs was observed using plane culture as control. By single cell sequencing, seven differentially expressed genes were found in the fertilized eggs of C57 mice cultured at 20 h after hCG 20 h hCG and 9 h in microgravity culture at 20 h after hCG. In this study, Kunming mice were used to study the relative expression of the seven differential genes Tmem59 (Tmem59) Teddm1bQ-PCR 1600010M07RikTts and Ndufa4Nts and Papolog, and compared with the results of single cell sequencing. The differential gene Ndufa4 was selected to study the functional mechanism of Ndufa4 by Q-PCR, vector construction, interference and microinjection. HCG was used as the control group (group A) for 20 h, the plane culture was continued for 9 h (group D), and the culture condition of microgravity was continued for 9 h (group E). By single cell sequencing, we found that there were seven genes in group E and D, which were more than 1.5 times different. In this study, seven single-cell sequencing results of Tmem59-Teddm1bC1600010M07RikNts and Papolog in fertilized eggs of Kunming mice showed that the relative expression of these seven genes in group D and E were significantly different from those in group D and E: Lars2Tmem59Ndufa4 and 16000M07Rikhe. No significant difference was found between Papolg and NTS, while the Teddm1b gene was not detected due to its low expression level. The accuracy of single cell sequencing was 66.7%. The Ndufa4 gene was preliminarily screened, and the expression vector and interference siRNAs of Ndufa4 were constructed by using the state of both female and male prokaryotes at 20 h after hCG as the fertilization marker. The effects of microinjection on the development of fertilized eggs were observed. The results showed that the blastocyst rate of mouse fertilized eggs decreased significantly after microinjection. The relative expression levels of Bcl-xl and Bcl-2 genes of Bcl family were detected by Q-PCR using microinjected water 20 h after hCG as control and pEGFP-Ndufa4 expression vector microinjected as experimental group. Bcl-xl and Bcl-2 were used as anti-apoptotic genes. The results showed that overexpression of Ndufa4 gene significantly increased the expression of Bax and Bak in mice, and the relative expression of cyt C protein, which caused apoptosis in mitochondria, was also significantly increased. The relative expression of Bcl-xl and Bcl-2 genes (Bcl-xl and Bcl-2) of Bcl family were detected by Q-PCR using microinjected water 20 h after hCG as control group and SiRNA microinjected with Ndufa4 as experimental group. The results showed that interfering with the expression of Ndufa4 gene in mice resulted in a significant increase in the relative expression of Bax. The overexpression or interference of Ndufa4 might affect the expression of apoptosis factors and eventually lead to apoptosis in fertilized eggs.
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q68

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本文编号：2146994