飞蝗miRNA的合成及对表皮代谢相关基因的调控机制研究

发布时间：2018-08-01 16:35

【摘要】：MicroRNAs(miRNAs)是一类在生物体内长度约为22 nt的内源性非编码RNA,通过转录后调控方式参与调节多种生命活动。飞蝗是世界性的重要农业害虫,表皮周而复始的合成与降解对其正常蜕皮发育起着重要作用。飞蝗表皮几丁质的代谢是一个复杂的生物学过程,几丁质的合成和降解过程主要由几丁质合成酶和几丁质酶等关键酶精确调控。本课题组前期研究已表明几丁质代谢酶—几丁质合成酶1(Chitin Synthase 1,CHS1)和几丁质酶10(Chitinase 10,CHT10)的精确表达在蜕皮发育中起关键作用;同时,我们的研究发现飞蝗miRNA合成通路中LmDicer1基因沉默抑制了成熟体miRNAs的合成,并导致蝗虫蜕皮异常而死亡。由此我们提出科学假设:飞蝗miRNAs可能参与调控表皮代谢关键基因,从而影响昆虫正常蜕皮发育。本文以重要农业害虫飞蝗为研究对象,研究了飞蝗LmDicer1和LmAGO1在mi RNA合成中的作用,更新了飞蝗miRNAs文库并揭示了miRNA对飞蝗表皮代谢基因的调控机制。主要内容如下:1、飞蝗小RNA文库的构建及miRNAs的鉴定通过高通量测序和实验验证,我们鉴定获得833个飞蝗miRNAs。发现随着飞蝗基因组的扩张其体内miRNA也相应增多,其中多个miRNAs是飞蝗特异的。采用RNAi技术干扰miRNA合成通路上的关键基因Drosha,并对其miRNA进行高通量测序,与对照组(dsGFP)相比进一步证明了miRNA库的真实性,飞蝗miRNA的鉴定研究为揭示miRNA在飞蝗体内的生物学功能奠定了基础。2、LmDicer1对miRNA合成及飞蝗蜕皮发育的影响为了阐明飞蝗miRNA合成通路中的关键因子Dicer1在miRNA合成中的作用及对飞蝗生命活动的影响,我们采用RNA干扰(RNAi)及荧光定量PCR(RT-qPCR)等技术分析LmDicer1的表达特性及对飞蝗体内miRNA合成的影响。结果表明:干扰LmDicer1可抑制飞蝗miRNA的合成,从而对飞蝗的蜕皮发育产生影响,导致飞蝗蜕皮异常而死亡。3、Argonaute 1在miRNA合成和飞蝗发育中的作用为了阐明miRNA合成通路中的关键因子Argonaute 1(AGO1)在miRNA形成中的作用,我们采用RNA干扰(RNAi)和荧光定量PCR(RT-qPCR)等技术分析LmAGO1的表达及对体内miRNA形成的影响。发现飞蝗AGO1蛋白不仅可以与miRNA形成RISC复合体指导miRNA与靶标基因结合,而且具有核酸内切酶的作用,参与体内成熟体miRNA的合成与表达,影响飞蝗正常生长发育。4、miRNAs对飞蝗表皮几丁质合成酶和降解酶基因的调控我们进一步研究了miRNAs在飞蝗蜕皮发育过程中的功能。利用生物信息学方法预测得到miR-71和miR-263分别与飞蝗CHS1和CHT10有结合位点;通过RT-qPCR检测发现miR-71和miR-263与LmCHS1和LmCHT10的表达呈负相关关系;利用体外荧光素酶实验和RNA免疫共沉淀(RIP)实验分析发现miR-71和miR-263分别与LmCHS1和LmCHT10有直接相互作用;通过体内显微注射miR-71/mi R-263的激动剂和抑制剂,发现在体内过表达或者沉默miR-71/miR-263,与对照组相比飞蝗因蜕皮困难而死亡。研究结果表明飞蝗miR-71和miR-263分别通过调控LmCHS1和LmCHT10的表达影响新表皮几丁质的合成和旧表皮几丁质的降解,导致飞蝗蜕皮异常而死亡。5、miRNAs对飞蝗表皮代谢基因的调控为了探究miRNAs是否对其他表皮代谢关键基因有调控作用,我们进一步选取了参与表皮代谢的关键基因:脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-N-acetylglucosamine pyrophorylase,UAP)、糖基转移酶(asparagine-linked glycosylation protein 5,ALG5)和Sinuous,通过生物信息学方法预测了与这些关键基因结合的潜在miRNAs,并通过RT-qPCR、体外免疫共沉淀(RIP)、体外荧光素酶等实验验证了表皮代谢基因与miRNAs之间的相互作用关系。结果表明与4个关键表皮代谢基因UAP、ALG5、FAS、和Sinuous潜在结合的miRNAs分别是miRNA-2796、miRNA-275、miRNA-276b和miRNA-184,而且这些miRNAs分别与4个表皮代谢基因之间有相互作用,可能调控了其靶标基因的表达。综上所述,本文系统阐明了飞蝗miRNAs的合成、鉴定并揭示了miRNAs在蜕皮发育中对表皮代谢相关基因的分子调控机制,研究结果将为筛选飞蝗防治中潜在的小分子靶标,设计环境友好型的绿色药物提供重要的科学依据。
[Abstract]:MicroRNAs (miRNAs) is a class of endogenous non coded RNA, which is about 22 NT in length, and participates in regulating a variety of life activities through post transcriptional regulation. Locust is an important agricultural pest in the world. The synthesis and degradation of epidermis plays an important role in the development of normal molting. The metabolism of chitin in cuticle epidermis is a The synthesis and degradation process of chitin is regulated by some key enzymes, such as chitin synthetase and chitinase, and the precise expression of chitin synthetase - chitin synthetase 1 (Chitin Synthase 1, CHS1) and chitinase 10 (Chitinase 10, CHT10) in the development of molt At the same time, our study found that LmDicer1 gene silencing in the miRNA synthesis pathway of locusts inhibited the synthesis of miRNAs in mature body and resulted in the abnormal death of locusts and molting. Therefore, we put forward scientific hypothesis that the miRNAs may participate in the regulation of key genes of epidermal metabolism and affect the normal molting development of insects. The effects of locusts LmDicer1 and LmAGO1 in the synthesis of MI RNA were studied, the miRNAs Library of locust and the regulatory mechanism of miRNA on the epidermal metabolism genes of locusts were updated. The main contents are as follows: 1, the construction of the small RNA Library of the locust and the identification of miRNAs by high throughput sequencing and experimental verification, we have identified 833 MiRNAs. found that with the expansion of the locust genome, the number of miRNA in the body increased correspondingly, and many of them were specific to the locust. RNAi technology was used to interfere with the key gene Drosha on the miRNA synthesis pathway, and the high flux sequencing of the miRNA was carried out. Compared with the control group (dsGFP), the authenticity of the miRNA library was further proved, and the miRNA of the locust was miRNA. Identification studies have laid the foundation for revealing the biological function of miRNA in the locust. The effect of LmDicer1 on miRNA synthesis and the development of the molting of locusts in order to clarify the role of Dicer1 in miRNA synthesis and the effect on the life of locust in the miRNA synthesis pathway of locusts, we use RNA interference (RNAi) and fluorescent quantitative PCR (RT-qP). CR) and other techniques to analyze the expression characteristics of LmDicer1 and the effect on miRNA synthesis in the locust. The results show that interference of LmDicer1 can inhibit the synthesis of miRNA in locusts, thus affecting the development of the molting of locusts, resulting in abnormal.3 of the molt of locusts, and the role of Argonaute 1 in the synthesis of miRNA and the development of locusts in order to clarify the miRNA synthesis pathway The key factor, Argonaute 1 (AGO1), in the formation of miRNA, we use RNA interference (RNAi) and fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) to analyze the expression of LmAGO1 and its effect on the formation of miRNA in the body. It is found that the AGO1 protein of locusts can not only combine with miRNA forming RISC complex to guide the binding of the target gene, but also have the nucleic acid internal cutting. The action of enzymes involved in the synthesis and expression of miRNA in the mature body of the body, affecting the normal growth and development of the locust,.4, and the regulation of miRNAs on the chitin synthetase and degrading enzyme genes of the cuticle epidermis. We further studied the function of miRNAs in the development of the molting of locusts. Using bioinformatics methods, we have predicted miR-71 and miR-263 and the CH of locust respectively. There was a binding site between S1 and CHT10, and the expression of miR-71 and miR-263 was negatively correlated with the expression of LmCHS1 and LmCHT10 by RT-qPCR detection. The use of in vitro luciferase experiment and RNA immunoprecipitation (RIP) experimental analysis found that miR-71 and miR-263 were directly used for LmCHS1 and LmCHT10, respectively. Agents and inhibitors were found to overexpress or silence miR-71/miR-263 in the body. Compared with the control group, locusts died of molting difficulties. The results showed that the miR-71 and miR-263 of locusts affected the synthesis of the new epidermal chitin and the degradation of the old epidermal chitin by regulating the expression of LmCHS1 and LmCHT10 respectively, resulting in the abnormal death of the cuticle and the death of.5 in the molting of the locust. MiRNAs regulates the epidermal metabolism genes of locusts in order to explore the regulation of miRNAs on other key genes of epidermal metabolism. We further selected key genes involved in epidermal metabolism: fatty acid synthase (FAS), UDP-N- acetaminophen pyrophosphorylase (UDP-N-acetylglucosamine pyrophorylase, U). AP), glycosyltransferase (asparagine-linked glycosylation protein 5, ALG5) and Sinuous predicted the potential miRNAs in combination with these key genes through bioinformatics, and tested the interaction between the epidermal metabolism gene and miRNAs through RT-qPCR, in vitro immunoprecipitation (RIP) and in vitro luciferase. The potential combination of 4 key epidermal metabolic genes, UAP, ALG5, FAS, and Sinuous, is miRNA-2796, miRNA-275, miRNA-276b and miRNA-184, respectively, and these miRNAs respectively interact with 4 epidermal metabolism genes, which may regulate the target gene expression. In summary, this paper systematically clarifies the combination of the miRNAs of locusts. The results will provide important scientific basis for the screening of the potential small molecular targets in the control of locusts and the design of environmentally friendly green drugs by identifying and revealing the molecular regulation mechanism of miRNAs in the development of molt.
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q963

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本文编号：2158175