猪EpCAM对细胞重编程和多能基因表达的调控机制

发布时间：2018-08-10 07:54

【摘要】：猪既是重要经济动物,又是一种理想的医学模型动物,获得猪多能干细胞对动物育种和再生医学研究有重要意义。但是,目前没有猪ESCs建系的报道,已报道建系的(包括本实验室之前报道的)猪iPS细胞依然存在诸多问题。深入研究猪多能性相关基因,发掘猪与小鼠和人的信号通路差异,能够为我们理解猪多能干细胞的分子调控机制提供帮助。国内外已经建系的猪iPSCs细胞中,EpCAM(epithelial cell adhesion molecule)呈现高表达。在人和小鼠中,EpCAM也可作为指示多能性的标记物而用于iPS和其他多能细胞的鉴定和筛选。除了作为多能性标记物外,EpCAM的胞内水解产物EpICD可进入细胞核,调节某些基因的表达。本研究以猪EpCAM基因和蛋白作为研究对象,通过检测EpCAM在猪组织和已经建系的猪iPS细胞中的表达情况,明确了EpCAM和猪多能性之间存在的联系;通过在iPS细胞中敲低和超表达EpCAM,建立了EpCAM与猪多能基因的调控关系;通过在猪体细胞向iPS诱导重编程过程中敲低或超表达EpCAM,发现了EpCAM及其裂解产物EpICD对细胞重编程过程起重要调控作用;最后,通过进一步对EpCAM蛋白调控和信号通路的研究,明确了EpCAM在猪多能细胞中的作用方式和途径。1.EpCAM基因的转录谱及其表达调控本研究通过检测猪组织、iPS细胞、早期胚胎发育过程中和细胞重编程过程中EpCAM的表达变化,试图建立EpCAM与猪多能性之间的联系;通过构建猪EpCAM启动子报告载体,尝试了解猪EpCAM基因在iPS细胞中的表达调控情况。结果表明,猪各组织中均能检测到EpCAM的表达,而在上皮细胞丰富的器官组织中,EpCAM表达量更高。在对建系的猪iPS细胞和猪成纤维细胞的比较中,EpCAM在各株iPS细胞中的表达水平均高于其前体细胞PEF,说明在重编程过程中EpCAM被激活;EpCAM的表达模式与关键的多能基因呈正相关,而与胚层分化基因呈现负相关;EpCAM的表达还与MET的相关基因呈现一定的相关性。对早期胚胎中的多能基因表达分析结果则说明,EpCAM在猪早期胚胎中的表达模式与关键多能基因的表达模式类似。OCT4和SOX2蛋白对EpCAM启动子具有下调作用,而KLF4、c-MYC、NANOG、LIN28、SALL4和ESRRB等多能转录因子对EpCAM启动子具有上调作用。2.EpCAM在细胞重编程过程中和iPS细胞中的调控作用利用构建的shRNA干扰载体和EpCAM超表达载体,观察其对PEF细胞诱导重编程过程的影响。敲低EpCAM表达会降低iPS诱导中的AP(alklin phosphatase,碱性磷酸酶)阳性克隆形成率,而超表达EpCAM则能够显著提高AP阳性率。在建系的猪DOX-iPS细胞中敲低EpCAM,导致内源OCT4、SOX2、LIN28、SALL4和ESRRB的表达显著下调,而超表达EpCAM则导致这些基因的显著上调。另外,敲低内源EpCAM的表达,DOX-iPS细胞克隆团的形态会出现松散状,表明EpCAM敲低导致的内源多能基因下调,进而造成iPS细胞出现分化状态。3.猪EpCAM相关信号通路本研究发现,猪EpCAM在细胞膜上经蛋白酶水解,能够产生一个胞内多肽EpICD。通过利用小分子抑制剂抑制蛋白酶TACE和PS-2活性,可以降低EpCAM的裂解,减少EpICD的产生。通过RT-PCR检测发现,在猪不同组织细胞中TACE和PS-2的m RNA水平存在差异,表明在不同细胞中,EpCAM可能存在不同的裂解效率,从而产生不同丰度的EpICD来调控其下游基因。通过在DOX-iPS细胞中添加TACE和PS-2的抑制剂,会使EpCAM靶基因OCT4,SOX2,LIN28和ESRRB等的表达量下调,说明EpCAM的转录调控作用是由其裂解产生的EpICD实现的。将超表达EpICD的载体转染DOX-iPS细胞,可以显著促进iPS细胞中EpCAM下游靶基因的表达水平。在对PEF细胞进行诱导重编程时,超表达EpICD可以提高形成克隆的AP阳性率。但是,在非iPS细胞培养条件下,在PEF中超表达EpICD无法激活EpCAM下游靶基因,而在培养体系中添加GSK3抑制剂CHIR99021,则EpCAM靶基因启动子可以被激活。原因是GSK3对beta-CATENIN的降解具有促进作用,抑制GSK3的表达可以提高beta-CATENIN的水平。因此,EpCAM依赖beta-CATENIN信号通路来发挥对下游靶基因的转录调控作用。
[Abstract]:Pig is not only an important economic animal, but also an ideal medical model animal. Obtaining porcine pluripotent stem cells is of great significance to animal breeding and regenerative medicine. However, there is no report on the establishment of the pig ESCs line at present. It has been reported that there are still many problems in the established pig iPS cells (including previous reports in the laboratory). Sex related genes, which discover the differences in the signaling pathways between pigs and humans, can help us understand the molecular regulatory mechanism of porcine pluripotent stem cells. EpCAM (epithelial cell adhesion molecule) is highly expressed in domestic and foreign established pig iPSCs cells. In humans and rats, EpCAM can also be used as a marker to indicate pluripotent activity. It is used for identification and screening of iPS and other pluripotent cells. In addition to being a pluripotent marker, the intracellular hydrolysate of EpCAM, EpICD, can enter the nucleus and regulate the expression of some genes. In this study, the porcine EpCAM gene and protein were used as the research object. By detecting the expression of EpCAM in pig and established pig iPS cells, the expression of EpCAM was determined. The relationship between EpCAM and porcine pluripotent activity was established. The regulation relationship between EpCAM and porcine pluripotent gene was established by knocking down and overexpressing EpCAM in iPS cells. By knocking down or overexpressing EpCAM in the process of reprogramming the pig somatic cells to iPS, it was found that EpCAM and its cracking product EpICD play an important role in the process of reprogramming of cell reprogramming. After further study on the regulation and signaling pathway of EpCAM protein, the mode of action of EpCAM in porcine pluripotent cells and the transcriptional spectrum of.1.EpCAM gene and its expression and regulation are clarified, and the changes in the expression of EpCAM during the detection of pig tissues, iPS cells, early embryonic development and cell reprogramming are tried to establish EpCA. The relationship between M and porcine pluripotent activity; the expression regulation of porcine EpCAM gene in iPS cells was attempted by building a porcine EpCAM promoter report vector. The results showed that the expression of EpCAM could be detected in all the tissues of the pig, and the expression of EpCAM was higher in the abundant organ tissues of the epithelial cells. In the porcine iPS cells and pigs that were built, the porcine iPS cells and pigs were formed. In the comparison of vascular cells, the expression level of EpCAM in all iPS cells was higher than that of PEF in the progenitor cells, indicating that EpCAM was activated during reprogramming; the expression pattern of EpCAM was positively correlated with the key pluripotent genes, but negatively correlated with the gene of the germ layer differentiation; the expression of EpCAM also showed a certain correlation with the related genes of MET. The multipotent gene expression analysis in the embryo shows that the expression pattern of EpCAM in the early porcine embryos is similar to that of the key pluripotent gene expression patterns..OCT4 and SOX2 proteins have a downregulation effect on the EpCAM promoter, while KLF4, c-MYC, NANOG, LIN28, SALL4 and ESRRB are up to regulate.2.EpCAM in the EpCAM promoter. The effect of shRNA interference carrier and EpCAM overexpression vector on the regulation of cell reprogramming and iPS cells was used to observe the effect on the reprogramming process of PEF cells. Low EpCAM expression could reduce the formation rate of AP (alklin phosphatase, alkaline phosphatase) positive clones in iPS induced, and the overexpression EpCAM could be significantly raised. The high AP positive rate. The expression of OCT4, SOX2, LIN28, SALL4 and ESRRB decreased significantly in the OCT4, SOX2, LIN28, SALL4 and ESRRB in the built pig cells, and the overexpression of EpCAM resulted in the significant up-regulation of these genes. Moreover, the expression of low endogenous EpCAM and the form of DOX-iPS cell clones appeared loosely, indicating the endogenous multiple energy caused by low EpCAM knockout. The gene down-regulation leads to the emergence of iPS cell differentiation state.3. EpCAM related signaling pathway. It is found that porcine EpCAM can produce an intracellular polypeptide EpICD. by protease hydrolysis on the cell membrane, which can reduce the fragmentation of EpCAM and reduce the production of EpICD by using small molecule inhibitors to reduce the activity of EpCAM and reduce the production of EpICD. Through RT-PCR, it can reduce the production of EpICD. The detection results showed that the m RNA levels of TACE and PS-2 in different tissues of pigs were different, indicating that in different cells, EpCAM may have different cracking efficiency, resulting in the production of different abundance EpICD to regulate its downstream genes. By adding TACE and PS-2 inhibitor in DOX-iPS cells, EpCAM target genes will be OCT4, SOX2, etc. The expression of EpCAM is downregulated, indicating that the transcriptional regulation of EpICD is realized by its lysis. Transfection of the vector of overexpression EpICD to DOX-iPS cells can significantly promote the expression level of the target gene of the downstream EpCAM in iPS cells. In the reprogramming of PEF cells, the overexpression of EpICD can increase the AP positive rate of the formation of the clone. However, under the condition of non iPS cell culture, the overexpression of EpICD in PEF can not activate the target gene of the downstream EpCAM, and the GSK3 inhibitor CHIR99021 is added to the culture system. The promoter of the EpCAM target gene can be activated. The reason is that GSK3 can promote the degradation of beta-CATENIN, and the expression of inhibition GSK3 can increase the beta-CATENIN level. EpCAM relies on beta-CATENIN signaling pathway to regulate the transcription of downstream target genes.
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S828

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本文编号：2175439