条件性基因敲除方法研究Ash21在小鼠肝脏及胚胎成纤维细胞中的功能

发布时间：2018-08-12 09:09

【摘要】：研究背景近年来,随着对肿瘤发病机制的深入研究,人们认识到肿瘤的发生不仅取决于基因自身的异常,还与组蛋白修饰等表观遗传调控的紊乱密切相关。进一步的研究还发现,细胞内特异性组蛋白修饰酶的表达情况又影响着相关组蛋白的修饰水平,其异常表达与肿瘤发生密切相关。组蛋白去乙酰化酶抑制剂Zolinza和Istodax作为抗肿瘤药物在美国上市,也从另一个角度证明了这一点。目前正有越来越多的研究开始关注与基因表观遗传调控密切相关的组蛋白修饰酶的功能,希望寻找到潜在的抗肿瘤药物作用靶点,进而干预肿瘤细胞的生长。在这众多的组蛋白修饰酶中,哺乳动物组蛋白H3赖氨酸4甲基转移酶(又称为KMT2酶)引起了很多研究者的关注。因为肿瘤基因图谱计划通过对人类肿瘤进行测序,指出KMT2家族的疾病相关特异性基因异常与乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、肺癌、肾癌、膀胱癌等多种肿瘤密切相关。对KMT2酶的研究,目前主要有两大思路。一是根据KMT2分为MLL1-4和SETIA/IB等几个不同亚型的研究结论,通过敲除不同的亚型研究每个亚型的KMT2的功能。研究已经发现,每一个KMT2亚型的功能都有其基因特异性,任一亚型的缺失都会导致小鼠出现严重的表现型。Mill-/-小鼠在胚胎发育阶段死亡,Mill-/-小鼠生长迟缓同时伴有造血系统的异常。还有许多研究证实MLL1蛋白的缺失与许多类型的人类白血病的发病相关。Mll2-/-小鼠胚胎发育缓慢,凋亡增加,常于胚胎发育的第10.5天死亡。另外,条件性敲除卵细胞的Mll2基因会导致排卵的中止和卵细胞的死亡；条件性敲除雄鼠生殖细胞的Mll2会导致雄鼠的不育。Setla-/-和Setlb-/-小鼠分别于胚胎发育的第5.5天和第11.5天死亡。二是根据KMT2酶含有包括WDR5、RbBP5、ASH2L和DPY30等核心蛋白的研究结论,通过敲除不同蛋白的方式研究每种核心蛋白和KMT2的功能,如ASH2L蛋白的缺失可导致KMT2酶催化活性的降低。由于敲除KMT2亚型的研究方法,无法排除敲除某一亚型后其他亚型的补偿作用,目前越来越多的研究倾向于运用敲除某一核心蛋白的方式研究KMT2的功能。已有的研究认为,敲除靶细胞内ASH2L基因所引起的H3K4me3修饰的下降不能被其他途径所代偿。关于ASH2L的研究,目前已经在其结构及功能两方面取得明显进展。在结构方面的研究,Ikegawa等于1999年成功克隆出了完整的人类ASH2L基因cDNA序列。人类ASH2L基因位于8号染色体,其基因组DNA长度跨越34 kb。迄今已被发现有3种剪接异构体,其中1型为最经典的亚型,由628个氨基酸组成,包含16个外显子,cDNA长2368 bp。对ASH2L1的结构分析发现其含有5个结构域,即N端的PHD和HWH结构域、中部的NLS核定位序列及C端的SPRY和SDI结构域。这种结构特点与ASH2L在细胞中的定位、蛋白间的相互作用及调控细胞的生物学行为密切相关。在功能研究方面,出于医学伦理的考虑及小鼠Ash21蛋白与人ASH2L蛋白具有高度同源性,目前绝大多数对ASH2L蛋白功能的研究都是以小鼠为研究对象。研究已发现,Ash2l-/-小鼠死于胚胎发育期；Ash21对维持胚胎干细胞(ES)的多向分化潜能及维持染色质的开放状态具有重要的作用；Ash21也可能参与到炎症反应、心肌肥大及肺动脉高压等疾病的发病过程中。本课题组的前期研究还发现,ASH2L蛋白与癌蛋白MYC相互作用；在人类乳腺癌等多种肿瘤组织中表达升高；能够与活化的Ha-RAS协同促进原代大鼠胚胎成纤维细胞的转化。由此可以推断：ASH2L极有可能作为癌基因发挥作用。本课题组在前期研究中试图在小鼠肝细胞内特异性地过表达ASH2L论证上述推测,但很遗憾该推测未能被证实。小鼠肝细胞内ASH2L的过表达并不能够诱发自发性肝癌或促进二乙基亚硝胺诱发的肝癌。过表达ASH2L不会影响肝细胞的生长、引起肝功能损害和肝脏组织学的改变。综上所述,既往的研究已经证明了ASH2L蛋白可以通过影响KMT2酶的活性而影响组蛋白修饰等基因的表观遗传调控。在ASH2L功能研究中,已经发现其在维持ES细胞多向分化潜能及胚胎发育等方面的作用,但具体到ASH2L与癌症的关系上却面临着困境。本课题组前期实验试图利用ASH2L的过表达方式研究其在肝癌发生中的作用但未获成功。本研究在前期研究的基础上,转换研究角度,不再通过ASH2L过表达的方式研究ASH2L的功能,而是通过敲除Ash2l方式反向推导Ash21蛋白的功能,这为深入研究ASH2L的功能奠定基础。研究目的1.构建条件性基因敲除动物模型,研究敲除Ash2l对小鼠肝脏及个体发育的影响。2.在小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)中条件性地敲除Ash2l,研究其对细胞生理功能的影响,并探讨其可能的机制。研究方法一、将基因型为Ash2lfl/fl的小鼠与Ash2l+/+Tg(AlbCre)的小鼠交配,得到子代Ash2l+/flTg(AlbCre)小鼠,让其后代继续交配,获得实验组Ash2l敲除(Ash2l KO)小鼠Ash2lf/flTg(AlbCre)及不同基因型的对照组小鼠(Ash2lfl/fl, Ash2l+/fl, Ash2l+/flTg(AlbCre), Ash2l+/+, Ash2l+/+Tg(AlbCre))。所获小鼠进行以下实验：1.每天观测小鼠的体重、一般情况、日常行为及临床监测指标等,并且给予评分,当实验组小鼠评分超过20分时终止实验。2. 处死小鼠前,称重小鼠并用毛细玻璃管从小鼠眼内眦眼眶后静脉丛取血。分离获得血清,进行碱性磷酸酶(ALP)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及总胆红素(TBIL)等与肝功能相关的酶学检测。3.采用PCR方法检测Ash2l在DNA和RNA水平上的敲除效率。4.采用Western blot方法检测蛋白水平上Ash21的表达情况。5.采用HE、PAS、Gomori染色等方法评价敲除Ash2l后肝脏组织学变化。6.采用免疫组织化学方法对小鼠肝脏组织切片进行染色,分析Ash21、H3K4me3、Ki67和γH2A.X等的含量。7.小鼠肝组织切片TUNEL染色及cleaved caspase-3免疫组织化学染色检测肝细胞凋亡的情况。二、将基因型为Ash2lfl/fl的小鼠与Ash2l+/+Tg(CAGCreERT2)的小鼠交配,让其后代继续交配,从孕13.5天的雌鼠体内筛选基因型为Ash2l+/+Tg(CAG-CreERT2)和Ash2lfl/flTg(CAGCreERT2)的小鼠胚胎,制备原代小鼠胚胎成纤维细胞(pMEFs)。采用磷酸钙瞬时转染的方法将含有p19ARF的质粒转染包装细胞Plat-E,并收集生成的逆转录病毒感染pMEFs。被病毒感染的pMEFs再经过相应抗生素筛选2周,获得永生化小鼠胚胎成纤维细胞(iMEFs)。所制备的pMEFs和iMEFs于对数生长期内进行以下实验：1.采用PCR和Western blot的方法分别检测Ash2l在DNA水平上的敲除效率和蛋白水平上的表达情况。2.通过绘制细胞生长曲线及亚甲蓝染色方法监测细胞的生长情况。3.采用PI染色结合流式细胞技术研究细胞周期的分布。4.采用Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞技术检测细胞凋亡。5.采用β-半乳糖苷酶染色方法检测细胞衰老。6.采用Western blot和免疫荧光染色方法检测细胞总体和单个细胞内Ash21、H3K4me3和γH2A.X的含量。7.采用Western blot方法检测敲除Ash2l可能引起的iMEFs内组蛋白修饰的改变。研究结果一、敲除Ash2l引起小鼠肝脏损伤。经过在DNA、RNA及蛋白水平上对Ash2l敲除效率的验证,成功构建了肝细胞特异性基因敲除小鼠模型。Ash2l KO小鼠形体较小,生长迟缓,活动减少。在终止实验前,6只Ash2l KO小鼠死亡,平均死亡年龄26.17±9.19天。与对照组相比,存活的雌性和雄性Ash2l KO小鼠的体重均明显下降(雌鼠：7.45±2.36 g(KO)vs.11.19±4.61 g(C),P0.05；雄鼠：6.56±1.05g(KO)vs.8.06±1.84 g(C),P0.05)血清酶学检测显示：Ash2l KO小鼠较对照组小鼠的ALP、ALT、AST水平明显升高(ALP:2022.20±195.70 U/L(KO)vs.467.05±52.01 U/L(C), P0.001;ALT:110.68±17.77 U/L(KO)vs.49.96±6.70 U/L(C),P0.001; AST:248.34±37.75 U/L(KO)vs.104.31±17.52 U/L(C),P0.001); TBIL水平也有所升高,但差异不具有统计学意义(48.26±12.33 μmol/L(KO)vs.17.90±10.42 μmol/L(C),P=0.070)小鼠肝脏的组织学分析显示,Ash2l KO小鼠肝细胞内Ash21蛋白表达下降同时伴有H3K4me3的缺失,但在肝脏其他类型的细胞中,仍可见Ash21蛋白及H3K4me3的存在,如Kupffer细胞和内皮细胞等。小鼠肝组织切片HE染色显示,不同基因型对照组小鼠的肝细胞形态学一致,未见明显异常,而Ash2l KO小鼠肝细胞胀大,胞浆呈疏松态,出现气球样变,并伴有羽毛状变性。且随着小鼠天龄的增加,Ash2l KO小鼠肝脏的胆管反应明显。PAS染色显示其含有蜡样质的巨噬细胞增多,改良的Gomori染色显示其部分区域内肝细胞塌陷,门静脉桥接纤维化。在超过11天龄的小鼠肝脏细胞中,敲除Ash2l可以引起Ki67升高,肝细胞核变大、深染。此外,Ash2l KO和对照组小鼠的肝细胞在cleaved caspase-3和TUNEL染色上无明显差异,在部分Ash2l KO小鼠肝细胞中γH2A.X升高。二、敲除Ash2l抑制细胞增殖。经过在DNA及蛋白水平上对Ash2l敲除效率的验证,成功建立了可诱导Ash2l敲除的MEFs.细胞生长曲线及亚甲蓝染色结果显示,敲除Ash2l可抑制MEFs的增殖。细胞周期分析结果显示,Ash2l KO pMEFs明显阻滞于G0/G1期,同时伴有S期细胞比例的明显下降。运用流式细胞技术检测经AnnexinV-FITC/PI染色的Ash2l KO MEFs的凋亡情况时发现：在干扰Ash21表达7天后,与对照组相比,iAsh2lfl/flMEFs在FSC和SSC轴上分布弥散,细胞凋亡显著增加(AnnexinV+:18.19±1.15% (+HOT)vs.7.55士1.49%(-HOT),P0.05:AnnexinV+PI-:10.38±0.49% (+HOT)vs.0.92±0.07%(-HOT),P0.001),而HOT的诱导并不能促进iAsh2l+/+ MEFs的凋亡(AnnexinV+:11.01±0.27%(+HOT)vs.11.92± 1.33%(-HOT),P=0.359:AnnexinV+PI-:2.14±0.17%(+HOT)vs.2.25 ±0.49%(-HOT),P=0.739).与iMEFs细胞凋亡检测结果一致,经过HOT诱导7天后,pAsh2lfl/flMEFs与对照组相比,凋亡细胞和早期凋亡细胞的比例均显著升高(AnnexinV+:34.13±0.85%(+HOT)vs.22.93±0.37% (-HOT),P0.001:AnnexinV+PI-:22.30±0.95%(+HOT)vs.13.00± 0.50%(一HOT),P0.001),pAsh2l+/+MEFs在经过HOT处理后与对照组相比无明显差异(AnnexinV+:24.62±1.72%(+HOT)vs.26.87±1.42%(-HOT),P=0.157:AnnexinV+PI-:13.60±0.46%(+HOT)vs.14.10±1.21%(-HOT),P=0.541)。此外,收集悬浮细胞进行细胞凋亡检测发现,iAsh2lfl/flMEFs在经过HOT诱导处理7天后有63.90±0.61%的悬浮细胞处于早期凋亡阶段。对照组iAsh2lfl/flMEFs(±HOT)及iAsh2lfl/flMEFs(-HOT)由于悬浮细胞极少,无法收集到足够的细胞用于凋亡检测。显微镜下观察发现,iAsh2l KO MEFs形态不规则,体积增大、扁平,细胞核变大。β.半乳糖苷酶染色显示,iAsh2lfl/flMEFs和iAsh2lfl/fl在经过HOT诱导5天后,p-半乳糖苷酶染色阳性细胞比例与未经HOT处理的对照组相比显著升高(iAsh2lfl/fl:65.04±4.35%(+HOT)vs.1.24±0.62%(-HOT), P0.001:iAsh2lfl/fl:72.19±3.17%(+HOT)vs.2.58±0.49%(-HOT), P0.001).iAsh2l+/+MEFs在经过HOT处理后,阳性细胞比例也明显升高,但均低于3%(iAsh2l+/+:2.59±1.01%(+HOT)vs.0.95±0.05%(-HOT), P=0.048:iAsh2l+/+:1.88±0.19%(+HOT)v.0.86±0.11%(-HOT),P =0.001).Western blot显示iAsh2l KO iMEFs内总体yH2A.X的含量升高,免疫荧光检测显示部分Ash21缺失的iMEFs内γH2A.X含量升高。采用Western blot方法检测敲除Ash2l后iMEFs内组蛋白修饰的改变,发现干扰Ash21表达后H3K4mel/me2/me3修饰水平下降,而对其他组蛋白翻译后修饰如H3K9ac、H3K9me3、H3K27ac和H3K27me3等没有影响。免疫荧光检测显示在Ash21缺失的iMEFs内H3K4me3的修饰也随之消失。结论1.成功构建的肝细胞特异性基因敲除动物模型证明,敲除Ash2l基因导致小鼠出生后肝脏功能受损、个体发育迟缓甚至死亡。2.Ash2l KO小鼠肝脏组织学的改变可能是由Ash21蛋白缺失引起的H3K4me3修饰异常所致。3.成功构建的可诱导条件性基因敲除MEFs证明,敲除Ash2l基因可以抑制细胞的增殖。4.Ash21蛋白缺失引发的细胞生长受抑可能是通过促进细胞衰老及一定程度上的细胞凋亡而形成的。研究意义1.首次建立了肝细胞特异性Ash21敲除动物模型,证明了Ash21基因对维持正常肝脏功能及个体发育具有重要意义。2.进一步研究并证明了Ash21基因对细胞增殖的作用。3.为ASH2L基因作为潜在的癌基因治疗靶点奠定理论基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R73-3
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本文编号：2178598