抗草甘膦aroAM1基因转化烟草的研究

发布时间：2016-12-18 18:29

  本文关键词：抗草甘膦基因aroAM12及抗虫基因Bts1m的转基因棉株，，由笔耕文化传播整理发布。

《兰州大学》 2009年

抗草甘膦aroAM1基因转化烟草的研究

闫广为  

【摘要】： 草甘膦是70年代开发的世界上最为成功的一种除草剂。由于具有广谱性,对环境无污染,对人和动物的健康几乎不影响,能除掉其他除草剂难以铲除的多种多年生植物等优点,这种除草剂被广泛使用。 近年来,抗草甘膦转基因作物的研究进展迅速。从1996年美国种植抗草甘膦转基因大豆开始,全球转基因作物的数量在逐年增加,然而这些品种几乎都是孟山都公司的专利,因此开发自主知识产权的、商业化的抗草甘膦作物,成为当前国内研究的重点。 5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)是草甘膦作用机理中的关键酶之一,它由aroA基因所编码。本实验所用基因为沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和大肠杆菌(Escherichia coli)中aroA基因的重组基因aroAM1。本实验通过农杆菌介导法,用农杆菌感染受伤的烟草叶片细胞,使外源基因aroAM1转化到烟草基因组中。最后,利用组织培养技术,再生出转基因烟草植株。 获得转aroAM1基因的农杆菌后,在优化的含有0.1μg/ml IAA,2μg/ml 6-BA,500μg/ml CB,24μmol/L草甘膦的培养基上培养烟草叶片,获得再生烟草植株。然后在三个不同水平上对再生烟草植株进行检测:在分子水平上,PCR检测阳性率为100%;在器官水平上,转基因的离体烟草叶片对草甘膦的抗性增加了12倍;在植株水平上,用5mmol/L草甘膦涂抹非转基因烟草和转基因烟草叶片,前者叶片枯黄,而后者变化不明显。本实验结果表明在优化的草甘膦抗性培养基上筛选烟草,可获得有明显抗性效果的转基因烟草植株。由于草甘膦的安全无污染等特点,以及本实验对aroAM1基因转入模式植物烟草中功能的验证,今后可深入的研究此基因在转基因植物的定位、目的蛋白EPSPS的表达以及草甘膦耐受机制等方面奠定基础。

【关键词】：
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：S572
【目录】：

摘要6-7

Abstract7-8

常用缩写词8-9

第一章 前言9-20

1.1 草甘膦简介9-11

1.1.1 草甘膦的理化性质9

1.1.2 草甘膦的作用特点9-10

1.1.3 草甘膦的作用机理10-11

1.2 获得抗草甘膦植物的方法11-12

1.2.1 促使EPSPS过量表达11

1.2.2 导入非敏感型的EPSPS11-12

1.2.3 转入降解草甘膦的基因12

1.3 EPSPS及其编码基因aroA的研究进展12-16

1.3.1 EPSPS的定位13

1.3.2 EPSPS的结构13-15

1.3.3 运用基因改造获得有抗性的EPSPS15-16

1.4 转抗草甘膦基因的主要方法和原理16-17

1.4.1 农杆菌介导法16-17

1.4.2 花粉管介导法17

1.4.3 基因枪转化法17

1.4.4 其它转化方法17

1.5 抗草甘膦转基因作物研究进展17-18

1.5.1 世界上抗草甘膦转基因作物的研究进展17-18

1.5.2 我国抗草甘膦转基因植物的研究进展18

1.6 本研究的目的意义18-20

第二章 实验材料与方法20-26

2.1 实验材料20-21

2.1.1 供试材料20

2.1.2 工具酶及其它试剂20-21

2.2 实验方法21-26

2.2.1 制备含有目的基因的农杆菌21-22

2.2.2 获得转化的烟草22-23

2.2.3 转基因烟草的鉴定23-24

2.2.4 EPSPS抗体的制备24-26

第三章 实验过程及结果26-38

3.1 获得含有aroAM1目的基因的农杆菌26-27

3.1.1 扩增质粒pAM1Bt的酶切鉴定26

3.1.2 菌落PCR的鉴定农杆菌LBA4404的转化26-27

3.2 获得转基因的烟草27-32

3.2.1 实验植物材料的获得27

3.2.2 草甘膦筛选浓度的确定27-30

3.2.3 侵染叶片再生的烟草植株30-31

3.2.4 获得烟草植株的PCR检测31-32

3.3 转基因烟草的检测32-36

3.3.1 转基因烟草植株离体叶片的抗性检测32-35

3.3.2 转基因烟草植株涂抹草甘膦的检测35-36

3.4 转基因烟草EPSPS抗体的制备36-38

第四章 实验讨论与结论38-40

4.1 讨论38

4.2 实验结论38-40

附表1 基本培养基40-42

参考文献42-46

致谢46

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