低磷胁迫大豆RT-qPCR内参基因的筛选及谷胱丙肽合成代谢酶的表达

发布时间：2018-08-24 17:25

【摘要】：磷是植物的必要元素之一,缺磷使植物的生长活动受到影响。谷胱甘肽(Glutathione,GSH)是普遍存在于植物体内的抗氧化剂,在植物抵抗低磷胁迫中起重要作用。GSH是植物细胞内主要的还原性物质,其通过Asada-Halliwell的方式,有效清除植物生理生化活动产生的过多的活性氧,保护植物体内生物大分子物质免受活性氧的伤害。GSH是在γ-谷氨酰半肮氨酸合成酶(γ-ECS)和谷胱甘肽合成酶(hGSHS)的催化作用完成的,y-ECS和hGSHS分别由γ-ECS和hGSHS基因编码。y-ECS和hGSHS基因表达量、γ-ECS和hGSHS酶活水平、GSH的含量之间相互作用来有效应对逆境胁迫。植物络合素(Phytochelatins,PC)是以GSH为反应底物合成的,PC可由外界重金属离子诱导产生,PC通过Cys上的硫基结构与重金属离子螯合以减少重金属离子对植物的毒害作用。大豆中的GSH类物质为谷胱丙肽(Homoglutataione,hGSH),hGSH几乎具有GSH的所有功能;同样大豆中的同源植物络合素(Homophytochelatin,hPC)亦能实现PC的所有功能。筛选稳定的内参基因是实时荧光定量 PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)的先决条件。本实验以大豆耐低磷品种桂夏2号(GX2)和低磷敏感品种桂香1号(GX1)为材料,对大豆进行1/5 Hoagland全营养液和低磷(0.2μmol/L KH2P04)处理,收集2 d、4d、8d、12d和16d根尖和叶片为材料,采用GeNorm分析法、NormFinder分析法、BestKeeper分析法、ACt对比分析法和RefFinder分析法分析低磷胁迫下15个内参基因(18sRNA,ACT,ATP,CYP,Ef1-α,Ef1-β,G6PDH,PE,PP2A,PSC,TIF,TUB,UNK1,UNK2,Letin)的稳定性,并选用最稳定的内参基因计算不同磷胁迫时期γ-ECS和hGSHS的表达水平,同时运用分光光度法研究了不同磷胁迫时期γ-ECS和hGSHS的酶活力水平,使用液质联用法检测了低磷胁迫下hGSH和hPCs的含量变化。结果:在所有样品组中最稳定性最好是PSC、18sRN和和TUB,稳定性排在最后的是PE和CYP;低磷实验组,稳定性最好的是PP2A;空白组,ACT是最稳定最好的内参基因;叶片中显示TIF稳定性最好;根部显示稳定性最佳的是PE。根据TUB)计算y-ECS和hGSHS的相对表达量(Fold change,FC)。低磷胁迫下,GX1根部和叶部γ-ECS和hGSHS的相对表达量都随着胁迫时间延长而呈现减少趋势;GX2根部γ-ECS和hGSHS的相对表达量都随着胁迫时间延长而增加;叶片中,γ-ECS的相对表达量亦呈现增加趋势,而hGSHS的相对表达量则减少;GX2的根部和叶部γ-ECS和hGSHS的酶活力都随胁迫时间的延长而上升,且根部上升的幅度要大于叶部,hGSH含量在GX2的根部和叶部也随着胁迫时间的延长呈现增加趋势;GX1中γ-ECS和hGSHS的酶活力和hGSH含量与GX2相比呈现相反趋势;hPCn(n=2～11)在低磷胁迫下大豆两个品种中根和叶中的含量基本为零。本实验说明了 γ-ECS和hGSHS酶活水平提高、hGSH含量增加是大豆抵抗低磷胁迫的分子机制之一;γ-ECS和hGSH基因的与hGSH的合成存在相互调控的关系;谷胱丙肽合成酶基因表达差异可能是品种磷效率差异的原因。
[Abstract]:Phosphorus is one of the essential elements in plants. Phosphorus deficiency affects plant growth. Glutathione (Glutathione,GSH) is a common antioxidant in plants, which plays an important role in plant resistance to low phosphorus stress. Effectively scavenging excess reactive oxygen species from plant physiological and biochemical activities, Protection of Biomacromolecules from reactive oxygen species in plants. GSH was performed by the catalytic action of 纬 -glutamyl semidaminic acid synthase (纬 -ECS) and glutathione synthase (hGSHS), and hGSHS was encoded by 纬 -ECS and hGSHS genes. Y-ECS and hGSHS, respectively. The interaction between the level of 纬 -ECS and the level of hGSHS activity in response to stress was due to the expression of 纬 -ECS and the content of GSH. Plant complex hormone (Phytochelatins,PC) is synthesized by using GSH as the substrate. It can be induced by external heavy metal ions to produce PC. It chelates with heavy metal ions through the structure of sulfur group on Cys to reduce the toxic effect of heavy metal ions on plants. Glutathione (Homoglutataione,hGSH) hGSH has almost all the functions of GSH, and the homologous phytocomplexin (Homophytochelatin,hPC) in soybean can also perform all the functions of PC. Screening stable internal reference genes is a prerequisite for real-time quantitative PCR (Real-time quantitative PCR,RT-qPCR). In this experiment, soybean cultivar Guoxia 2 (GX2) and sensitive cultivar Guixiang 1 (GX1) were treated with 1 / 5 Hoagland total nutrient solution and 0. 2 渭 mol/L KH2P04 for 2 d, 4 d, 8 d, 12 d and 16 d, respectively. GeNorm analysis method was used to analyze the stability of 15 internal reference genes (18 s RNA-ACTT) CYPf1- 伪 Ef1- 尾 (G6PDHPEP), and the most stable internal reference genes were used to calculate the expression levels of 纬 -ECS and hGSHS in different phosphorus stress periods. The results showed that the stability of PP2An PSC-PSCTUBUNK1 and UNK2Letin was calculated by using the most stable internal reference gene under low phosphorus stress, and the stability of CYP1- 伪 Ef1- 伪 Ef1- 尾 (G6PDHP1- 尾) gene was calculated by using the most stable internal reference gene to calculate the expression level of 纬 -ECS and hGSHS in different phosphorus stress periods. At the same time, the enzyme activities of 纬 -ECS and hGSHS in different phosphorus stress periods were studied by spectrophotometry, and the changes of hGSH and hPCs contents under low phosphorus stress were detected by liquid-mass spectrometry. Results: among all the sample groups, the stability of PSC,18sRN and TUB, was the best, the stability of PE and CYP; was the lowest, the stability of PP2A; blank group was the most stable and the stability of PP2A; was the most stable and the stability of TIF was the best. The best indication of stability at the root is PE. The relative expression of y-ECS and hGSHS (Fold change,FC) was calculated according to TUB. Under low phosphorus stress, the relative expression of 纬 -ECS and hGSHS in roots and leaves of GX1 decreased with the prolongation of stress time. The relative expression of 纬 -ECS and hGSHS in root of GX2 increased with the prolongation of stress time. In leaves, the relative expression of 纬 -ECS also showed an increasing trend, while the relative expression of hGSHS decreased the activity of 纬 -ECS and hGSHS in roots and leaves of GX2 increased with the prolongation of stress time. The content of hGSH in the roots of GX2 increased with the prolongation of stress time. The activity of 纬 -ECS and hGSHS in GX1 and the content of hGSH in GX1 showed the opposite trend compared with that of GX2. The content of root and leaf in two soybean varieties was basically zero. The results showed that the increase of activity level of 纬 -ECS and hGSHS was one of the molecular mechanisms of soybean resistance to low phosphorus stress, and there was a mutual regulation between 纬 -ECS and hGSH genes and the synthesis of hGSH. The difference of glutathione synthase gene expression may be the reason for the difference of phosphorus efficiency.
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S565.1;Q943.2

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本文编号：2201516