1、FHL2与iASPP相互作用对白血病细胞增殖和凋亡的影响 2、MLL-MYH11融合基因的鉴定和扩增

发布时间：2018-10-21 18:21

【摘要】：研究目的:p53抑制因子iASPP在急性白血病中高表达,抑制白血病细胞凋亡,促进白血病发生。为明确其机制,我们通过酵母双杂交技术首次发现FHL2能够与iASPP相互作用,并对FHL2和iASPP的相互作用对白血病细胞增殖和凋亡的影响及其机制进行了深入研究。研究方法:通过酵母双杂交技术筛选出与iASPP相互作用的蛋白FHL2。利用实时定量PCR方法检测急性白血病病人和白血病细胞系中FHL2基因的表达水平。利用免疫荧光共聚焦、免疫共沉淀和免疫印迹方法证明FHL2和iASPP相互作用。构建pcDNA3.1-FHL2-myc表达载体及FHL2各个结构域的表达载体,分别与pcDNA3.1-iASPP-flag共同过表达于293T细胞,通过免疫共沉淀联合免疫印迹技术确定与iASPP相互作用的FHL2的具体结构域。分别构建FHL2和iASPP的shRNA干扰载体PLKO.1,制备慢病毒并感染K562和Kasumi-1细胞,敲降FHL2或iASPP表达水平;利用MTT方法检测细胞增殖,以流式细胞术分析细胞凋亡率及细胞周期的变化;利用免疫印迹方法分析细胞周期调节因子和抗凋亡蛋白的表达水平。通过双荧光素酶报告基因系统检测FHL2和iASPP的相互作用对p53下游基因转录调控的影响。研究结果:FHL2在初治急性红白血病病人中的表达水平明显高于其它急性髓细胞白血病亚型,在K562、Kasumi-1细胞系中的表达水平明显高于KG-1a、NB4、U937和SKNO-1等其它白血病细胞系。FHL2和iASPP能够相互作用,有亚细胞共定位现象,且FHL2的L1/2-3部分是与iASPP相互作用的必需结构域。无论干扰FHL2还是iASPP的表达,K562和Kasumi-1细胞增殖都明显受到抑制,细胞凋亡增加,细胞明显阻滞于G0/G1期;p21和p27表达明显增加,CDK4、E2F1、CyclinE和抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低。在K562和Kasumi-1细胞中,干扰FHL2的表达后,iASPP的表达也减少,同样,干扰iASPP的表达后,FHL2的表达也减少,表明两者的表达具有协同一致性。iASPP抑制p53对BAX转录激活作用的同时,再转入shFHL2,能够逆转iASPP对p53的抑制作用,且具有剂量依赖性。研究结论:FHL2在急性红白血病中的表达水平高于其它急性髓细胞白血病亚型。本研究首次发现FHL2和iASPP在AML细胞中相互结合。敲降FHL2或iASPP的表达可明显抑制K562和Kasumi-1白血病细胞的增殖,促进细胞凋亡,使细胞阻滞于G0/G1期;同时p21和p27表达增加,CDK4、E2F1、CyclinE和抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低。FHL2和iASPP的表达具有协同一致性。另外,iASPP和FHL2参与调节p53的转录激活作用。以上研究结果提示FHL2有望成为AML潜在的新的治疗靶点。研究目的:在对临床工作中遇到的疑难急性髓系白血病(AML)M5b病例研究中,我们发现了一个新的t(11;16)(q23;p13)变异易位。我们利用转录组测序和PCR方法发现并鉴定了 MLL-MYH11融合基因,这是目前尚未报道过的MLL融合基因。本研究通过对全新的MLL融合基因进行编码序列扩增和蛋白结构分析,从而进一步增加人们对MLL融合基因的认识。研究方法:采用转录组测序方法发现MYH11是MLL的对手基因,通过PCR鉴定患者确实携带全新的融合基因MLL-MYH11。通过PCR分段扩增MLL-MYH11,以overlap PCR或酶切连接方法将各段序列连接起来,并构建MLL-MYH11的慢病毒载体。用多聚乙烯亚胺(PEI)转染293T细胞后,利用real-time PCR 鉴定 MLL-MYH11 的 mRNA 表达水平。研究结果:我们对临床工作中遇到的一例携带t(11;16)(q23;p13)染色体易位的疑难AMILM5b病例进行研究,发现了一个全新的MLL融合基因—MLL-MYH11融合基因。MLL-MYH11融合基因全长9948bp,编码一个含有3315个氨基酸残基的融合蛋白。MLL-MYH11融合基因符合MLL融合基因的特点,累及MLL基因并且包含MLL基因7号外显子及其5'序列,所编码的融合蛋白含有MLL的3个AT吊钩(AThooks),2个核定位信号:SNL1和SNL2,1个转录抑制结构域:RD1和RD2,以及MYH11的全部编码序列。HEK293T转染MLL-MYH11融合基因后,其mRNA水平显著升高,但未检测到融合蛋白。研究结论:在本次研究中,我们发现了一个全新的MLL融合基因MLL-MYH11,并扩增得到其编码序列全长,分析了该融合蛋白的结构,其在白血病发生中的作用尚待进一步研究。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R733.7

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本文编号：2285957