【摘要】：背景:氟伐他汀(fluvastatin,FV)隶属羟甲戊二酰辅酶A(HMG-Co A)还原酶抑制剂家族,可以明显降低血浆低密度脂蛋白水平。FV在肝脏中主要经细胞色素P450 2C9酶(CYP2C9)代谢,且CYP2C9基因具有明显的多态性。在临床上常将丹参制剂和他汀类药物联合应用于高胆固醇血症等心血管疾病的治疗,本课题组前期研究发现丹参可明显升高大鼠体内他汀类药物的浓度,这个现象是否为他汀类药物的体内代谢受到干扰而致尚不清楚,值得探究。目的:探究中药丹参的八种组分(丹参素,原儿茶酸,原儿茶醛,丹酚酸B,隐丹参酮,二氢丹参酮Ⅰ,丹参酮Ⅰ,丹参酮ⅡA)对HLMs催化FV代谢的影响;研究不同基因型重组酶催化代谢FV的差异,以及基于CYP2C9的基因多态性(*1*2*3)研究丹参组分对FV代谢的影响机制。方法:1.建立HLMs及重组酶孵育体系中FV的HPLC分析方法;2.建立FV在HLMs及重组酶中代谢的孵育体系及样品处理方法;3.在实验优化孵育时间,酶蛋白浓度的基础上,选取系列浓度的FV,拟合FV在HLMs中的酶代谢动力学曲线,求算酶动力学参数Km,Vmax和CLint,用以分析HLMs催化代谢FV的酶动力学特征;4.选取八种丹参组分:丹参素,原儿茶酸,原儿茶醛,丹酚酸B终浓度1,10,100μM,隐丹参酮,丹参酮Ⅰ,丹参酮ⅡA终浓度1,10,60μM,二氢丹参酮Ⅰ终浓度1,10,40μM,分别与底物FV(1μM)共同孵育,采用已建立的HPLC检测方法获得FV的峰面积,通过公式:剩余酶活性%=(灭活组FV峰面积-丹参组分组FV峰面积)/(灭活组FV峰面积-不加丹参组分FV峰面积)×100%,比较八种丹参组分对FV代谢抑制的剩余酶活性,初步判断八种丹参组分对FV代谢的影响;5.在优化孵育时间,酶蛋白浓度的基础上,选取系列浓度的FV,拟合FV在CYP2C9*1,*2,*3重组酶中代谢的酶动力学曲线,求算酶代谢动力学参数Km,Vmax和CLint,比较不同基因型CYP2C9代谢FV的差异,分析CYP2C9基因多态性对FV酶代谢动力学特征的影响;6.基于CYP2C9基因多态性研究隐丹参酮,二氢丹参酮Ⅰ,丹参酮Ⅰ对FV代谢的影响。系列不同浓度的隐丹参酮,二氢丹参酮Ⅰ,丹参酮Ⅰ分别与FV(1μM)共同孵育,通过非线性曲线拟合求算IC50值;系列隐丹参酮,二氢丹参酮Ⅰ,丹参酮Ⅰ浓度点,分别与FV(0.5,1,2μM)共同孵育,通过Lineweaver-Burk作图和Dixon作图求算Ki值。确定三种丹参组分对FV代谢的抑制作用,并比较不同基因型CYP2C9抑制FV代谢的差异,从而分析隐丹参酮,二氢丹参酮Ⅰ,丹参酮Ⅰ对FV代谢影响的可能机制。7.数据处理与统计分析:论文中实验数据都以均数土标准差(Mean±SD)表示,采用SPSS19.0统计软件对数据进行分析处理,组间差异用单因素方差分析(One-way ANOVA)和T检验,结果以P0.05表示差异具有统计学意义,P0.05表示差异无统计学意义。结果:1.研究中建立的HPLC检测方法,符合HLMs及重组酶中FV的检测要求,孵育体系中杂志不干扰样品测定,特异性良好,线性范围为0.1-16μM,定量下线为0.1μM,精密度,准确度,以及提取回收率均符合生物样本分析的要求。2.建立的HLMs以及重组酶催化代谢FV的孵育体系以及样品处理方法完全符合本实验的要求,且在实验中经过多次验证,稳定性良好。3.HLMs中的研究结果显示:通过设置系列的孵育时间,蛋白浓度,我们探索得出FV在HLMs中最佳的孵育时间为100min,最佳的酶浓度为0.25mg/m L,0.1-16μM的FV在HLMs中代谢的酶动力学参数Km,Vmax,CLint数值分别为1.13±0.18μM,5.52±0.25pmol/min/mg,4.88μL/min/mg。4.HLMs中的研究结果显示:在丹参素,丹酚酸B,原儿茶醛,原儿茶酸100μM和丹参酮ⅡA 60μM时,其介导FV代谢的剩余酶活性分别是90.37%,106.14%,92.70%,100.23%,101.40%没有显示出抑制作用,然而在10μM时,隐丹参酮,二氢丹参酮Ⅰ,丹参酮Ⅰ对FV代谢的剩余酶活性分别为42.73%,14.52%,17.20%显示出了明显的抑制作用,因此我们选择此三种丹参组分在CYP2C9的重组酶上进行下一步的实验探索。5.CYP2C9*1,*2,*3重组酶实验显示:*1,*2,*3代谢FV的酶动力学参数Km分别是1.56±0.21,1.79±0.25,2.32±0.43μM;Vmax分别是41.75±1.67,26.55±1.08,12.85±0.79pmol/min/mg;CLint分别是26.71,14.86,5.53。统计比较两个突变体(*2,*3)与野生型(*1)的Km,Vmax,CLint显示*1的代谢活性大于*2,*3。6.隐丹参酮抑制CYP2C9*1,*2,*3代谢FV的IC50值分别为1.74±0.41,2.64±0.81,3.17±0.32μM(与*1相比P0.05),Ki值分别为1.52±0.69,3.84±0.95,4.53±0.43μM(与*1相比P0.05);二氢丹参酮Ⅰ抑制CYP2C9*1,*2,*3代谢FV的IC50值分别是0.19±0.09,0.56±0.16,1.52±0.34μM(与*1相比P0.01),Ki值分别是0.20±0.07,0.42±0.11,0.97±0.22μM(与*1相比P0.05);丹参酮Ⅰ抑制CYP2C9*1,*2,*3代谢FV的IC50值分别是1.12±0.20,1.61±0.36,2.36±0.33μM(与*1相比p0.05),Ki值分别是0.90±0.11,0.66±0.08,1.89±0.18μM(与*1相比p0.01),以上数据表明:隐丹参酮,二氢丹参酮Ⅰ,丹参酮Ⅰ对不同突变CYP2C9重组酶催化FV代谢均具有明显的抑制作用,其中隐丹参酮,丹参酮Ⅰ对其显示出中等强度的抑制作用,二氢丹参酮Ⅰ对CYP2C9*1,*2催化FV的代谢展示出强抑制作用,对*3显示出中等强度的抑制作用,且差异有统计学意义。结论:综上实验研究我们得出如下结论:1.丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、丹酚酸B和丹参酮ⅡA对HLMs代谢FV无抑制作用;隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ却显示出明显的抑制作用。2.CYP2C9*2(430CT)和CYP2C9*3(1075AC)突变可影响重组酶代谢FV的活性。3.隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ对不同基因型的CYP2C9重组酶代谢FV均有明显抑制作用,但抑制程度存在差异,三者对野生型*1的抑制作用大于两个突变型*2与*3,提示430和1075位突变可能是影响隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ与CYP2C9结合的重要位点。
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【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【参考文献】
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本文编号：
2297252
