合浦珠母贝BMP3和BMP10基因的克隆与功能初步研究

发布时间：2018-11-14 15:56

【摘要】：合浦珠母贝(Pinctada fucata)是最主要的海水产珠贝,具有一系列优秀的经济性状。但近年来面临种质退化、育珠质量差等问题,严重制约珍珠贝产业发展。通过选育优良品种来提振产业发展显得尤为紧迫。利用分子标记辅助育种技术加强重要经济性状尤其是生长和育珠性状的选育是一条可行途径。为此需要着重加强合浦珠母贝基础生理的研究,包括发育调控、贝壳形成等。骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic proteins,BMPs)是一类多功能细胞因子,包含众多成员。其中大多数都具有成骨活性,另外这类蛋白在胚胎发育、组织发生、生殖调控等方面也有重要作用,但在软体动物中相关研究还很少。本研究以本课题组的合浦珠母贝转录组数据为基础,克隆了两个BMP家族基因BMP3和BMP10,并初步尝试探究其功能。具体结果如下:1.合浦珠母贝BMP3基因的克隆与功能初步研究。该研究以从转录组数据中获得的注释为BMP3同源基因的片段为基础,通过RACE技术获得合浦珠母贝BMP3基因完整c DNA序列。该基因c DNA全长2710 bp,包含开放阅读框(ORF)1470 bp,5'非翻译区(UTR)350 bp,3'UTR 890 bp,3'端有典型的加尾信号(AATAAA)。将该基因命名为Pf BMP3(Gene Bank登录号:KT956999)。Pf BMP3基因编码489个氨基酸,预测其分子量为56.64 k Da,理论等电点(PI)为9.80。跨膜结构预测表明Pf BMP3编码蛋白位于胞外且无跨膜结构。信号肽预测Pf BMP3编码蛋白带有一个N端信号肽(1-21 aa)。功能结构域预测显示Pf BMP3编码蛋白含有一个前结构域(22-361 aa)和成熟蛋白区(362-489 aa),存在特殊的成熟区剪切位点结构Arg-X-X-Arg。成熟蛋白区包含128个氨基酸残基,预测其分子量为14.59 k Da,理论等电点为8.90。成熟蛋白区包含一个转化生长因子β(Transforming growth factor beta,TGF-β)结构域(387-489 aa),TGF-β结构域包含7个半胱氨酸残基。针对合浦珠母贝担轮幼虫期、D-型期、壳顶期、眼点期、变态期共5个发育时期的实时荧光定量PCR分析显示,Pf BMP3高表达于担轮期和变态期,提示Pf BMP3参与幼体担轮期、变态期的发育调控。针对外套膜、鳃、肠、闭壳肌、珍珠囊、肝胰腺、性腺、血细胞共8种组织的实时荧光定量PCR分析显示Pf BMP3在鳃和外套膜高表达。针对外套膜组织的原位杂交分析显示,Pf BMP3高表达于外套膜内褶的内表皮和中褶的外表皮,另外在外套膜外侧上皮细胞也有表达。推测Pf BMP3参与贝壳的形成。贝壳缺刻实验显示缺刻处理24小时后Pf BMP3在外套膜中的表达量显著上升,缺刻处理36小时后Pf BMP3在鳃中的表达量显著上升。表明Pf BMP3可能与贝壳的损伤修复相关。将合浦珠母贝在不同钙离子浓度水体下养殖三个月后,分析鳃和外套膜组织的Pf BMP3基因表达量,表明Pf BMP3在低钙离子浓度组(添加EDTA组)的表达量显著高于海水组和高钙离子组(添加氯化钙组)。和已被证明参与钙离子代谢的钙调蛋白(Calmodulin,Ca M)基因有相似的变化趋势。表明Pf BMP3可能参与贝壳形成过程中的钙离子代谢调控。对Pf BMP3基因进行RNA干扰后,检测Pf BMP3和Pf Ca M的表达量变化,显示Pf Ca M的表达量出现下降。因此推测Pf BMP3基因在贝壳形成过程中可能通过与Pf Ca M的某种关联作用来调控钙离子代谢。2.合浦珠母贝BMP10基因的克隆与功能初步研究。以从转录组数据中获得的注释为BMP10同源基因的两个片段为基础,扩增补全中间序列,在此基础上通过RACE技术获得合浦珠母贝BMP10基因c DNA序列。该基因c DNA长1752 bp,包含开放阅读框(ORF)1344 bp,5'UTR 293 bp,3'UTR 115 bp。将该基因命名为Pf BMP10(Gene Bank登录号:KU529148)。Pf BMP10基因编码447个氨基酸,预测其分子量为51.92 k Da,理论等电点(PI)为6.14。跨膜结构预测显示Pf BMP10编码蛋白蛋白位于胞外且无跨膜结构。信号肽预测Pf BMP10含有一个N端信号肽(1-23 aa)。功能结构域预测显示Pf BMP10编码蛋白含有一个前结构域(24-337 aa)和成熟蛋白区(338-447 aa)。带有成熟区剪切位点结构Arg-X-X-Arg。成熟蛋白区包含一个TGF-β结构域(344-447 aa),TGF-β结构域含有7个半胱氨酸残基。针对合浦珠母贝担轮幼虫期、D-型期、壳顶期、眼点期、变态期共5个发育时期的荧光定量PCR实验显示,Pf BMP10高表达于担轮幼虫期和变态期,预示Pf BMP10可能参与合浦珠母贝幼体担轮幼虫期、变态期发育调控。针对成体贝外套膜、鳃、肠、闭壳肌、珍珠囊、肝胰腺、性腺、血细胞共8种组织的实时荧光定量PCR分析显示Pf BMP10在鳃和外套膜高表达。推测Pf BMP10参与贝壳的形成。贝壳缺刻实验显示缺刻处理24小时后Pf BMP10在鳃和外套膜中的表达量均显著上升,表明Pf BMP10可能与贝壳的损伤修复相关。该研究可为BMP家族基因功能及贝壳形成机理研究提供参考。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4

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本文编号：2331623