siRNA敲减DNMT1表达对T-cadherin基因甲基化及结肠癌细胞生物学行为的影响

发布时间：2018-11-15 08:19

【摘要】：目的肿瘤的发生、发展和侵袭转移是影响结肠癌治疗的重要原因,有研究发现DNA甲基化状态在肿瘤的发生、发展中起着重要作用,抑制T-cadherin表达可增强肿瘤细胞侵袭和迁移能力。本研究探讨siRNA敲减DNA甲基转移酶1(DNA methyl transferase 1,DNMT1)基因表达对结肠癌细胞T-cadherin基因甲基化及细胞生物学行为影响。方法设计针对DNMT1的siRNA1、siRNA2和siRNA3重组质粒,分别转染HT-29、SW620和HCT116细胞系,采用实时荧光定量PCR检测DNMT1表达,以筛选敲减效率最高的DNMT1siRNA和细胞系。用敲减效率最高的DNMT1siRNA转染相应细胞系,采用甲基化特异性PCR检测T-cadherin甲基化水平,采用实时荧光定量PCR和蛋白印迹法检测T-cadherin表达。用敲减效率最高的DNMT1siRNA转染相应细胞系,采用噻唑蓝比色法、流式细胞术、Transwell和细胞划痕实验检测细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移情况,观察敲减DNMT1对细胞生物学行为的影响;同时设置T-cadherin shRNA重组质粒转染组,观察同时敲减DNMT1和T-cadherin对细胞生物学行为的影响。结果 DNMT1siRNA1重组质粒对HT-29细胞系DNMT1的敲减效果最好。DNMT1siRNA1转染HT-29细胞后,DNMT1组T-cadherin基因甲基化水平明显低于空质粒组和空白组,DNMT1组与空质粒组(F=314.182)和空白组(F=283.625)差异有统计学意义,均P0.001。DNMT1组和联合组DNMT1mRNA表达量(0.27±0.08)和蛋白表达量(0.41±0.12)显著低于空质粒组和空白组。其中mRNA表达,DNMT1组与空质粒组(F=544.581)和空白组(F=525.811)组差异有统计学意义,均P0.001;联合组与空质粒组(F=507.501)和空白组(F=494.958)也差异有统计学意义,均P0.001。蛋白表达量,DNMT1组与空质粒组(F=217.550)和空白组(F=275.469)差异有统计学意义,均P0.001:联合组与空质粒组(F=321.707)和空白组(F=407.225)也差异有统计学意义,均P0.001:而DNMT1组和联合组比较mRNA(F=0.002,P=0.965)和蛋白表达量(F=0.811,P=0.394)均差异无统计学意义。DNMT1组T-cadherin mRNA表达量(1.17±0.34)和蛋白表达量(1.38±0.54)显著高于联合组、空质粒组和空白组。其中mRNA表达,DNMT1组与联合组(F=433.103)、空质粒组(F=313.768)、空白组(F=372.118)差异有统计学意义,均P0.001。对于蛋白表达量,DNMT1组与联合组(F=89.315)、空质粒组(F=156.745)、空白组(F=196.702)差异有统计学意义,均P0.001。而联合组与空质粒组(F=1.310,P=0.262;F=0.144,P=0.714)和空白组(F=3.713,P=0.064;F=0.038,P=0.850)的mRNA和蛋白表达量比较差异无统计学意义。与联合组、空质粒组和空白组比较,DNMT1组第24、36、48、72h的A值显著减小,F组别=14.479,P0.001;F时间=37.755,P0.001。DNMT1组与联合组(F=1 004.194,P0.001)、空质粒组(F=1 190.815,P0.001)、空白组(F=781.018,P0.001)比较细胞总凋亡率显著升高;DNMT1组穿膜细胞数目为(61.3±10.7)个,与联合组(F=86.730,P0.001)、空质粒组(F=282.962,P0.001)、空白组(F=152.538,P0.001)比较显著减少。DNMT1组细胞迁移距离为(235.8±6.3)μm,与联合组(F=2 535.55,P0.001)、空质粒组(F=9 767.233,P0.001)、空白组(F=8 420.830,P0.001)比较显著减少。而联合组与空质粒组和空白组比较,A值、细胞总凋亡率、穿膜细胞数目和细胞迁移距离均差异无统计学意义,P0.05。结论 DNMT1siRNA1可有效敲减HT-29细胞DNMT1表达,逆转T-cadherin高甲基化状态并上调其表达。敲减DNMT1可明显抑制HT-29细胞增殖,促进其凋亡,降低其侵袭和迁移能力;而同时敲减T-cadherin能够逆转此种现象,说明敲减DNMT1引起的细胞生物学行为改变可能是通过T-cadherin来实现的。
[Abstract]:......
【作者单位】： 重庆市第九人民医院普外科;重庆市第九人民医院急诊科;
【基金】：重庆市卫生局医学科研项目(2012-2-291)
【分类号】：R735.35

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本文编号：2332723