腺病毒介导Tum5重组基因对角膜新生血管的抑制

发布时间：2018-11-21 07:20

【摘要】：研究目的研究腺病毒介导Tum5重组基因过表达对生理状态下人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)的增殖、迁移及管腔成形影响;观察其碱烧伤模型诱导角膜新生血管的抑制作用,并初步探讨可能的机制。研究方法构建表达绿色荧光蛋白(r Ad-GFP)空载体腺病毒和携带重组Tum5基因腺病毒载体(r Ad-Tum5),转染HUVEC,在倒置荧光显微镜下观察并计算其转染效率,用Western blot检测Tum5的表达情况。将HUVEC分为正常对照组,空载体对照组(r Ad-GFP组)和Tum5基因组(r Ad-Tum5组);用r Ad-GFP和r Ad-Tum5病毒颗粒(1×1010/ml)分别转染相应组别的细胞,48 h后,采用细胞计数试剂盒(CCK-8)、侵袭小室(Transwell)实验及基质胶(Matrigel)分别检测细胞的增殖、迁移和管腔成形。另外,用人VEGF ELISA试剂盒检测转染后24、48、72 h的细胞上清液中VEGF的含量。通过构建大鼠角膜碱烧伤模型研究角膜新生血管。将大鼠分为四组:(1)正常组;(2)生理盐水组;(3)r Ad-GFP组;(4)r Ad-Tum5。碱烧伤后第1天,在球结膜下注射20μl r Ad-Tum5、r Ad-GFP病毒注射,碱烧伤组注射等体积的无菌生理盐水,正常对照组不做处理。分别于碱烧伤后第7天、第14天摘取大鼠眼球,行石蜡切片,通过HE染色观察角膜新生血管生长状况,以及计数炎症细胞数目,行统计学分析:在烧伤后第1天、第7天、第14天在裂隙灯显微镜下观察大鼠角膜水肿以及新生血管情况,并拍照测量新生血管面积,行统计学分析。研究Tum5对角膜新生血管的抑制。结果倒置荧光显微镜下可见r Ad-GFP组和r Ad-Tum5组HUVEC细胞呈清晰的绿色荧光,提示GFP表达,腺病毒转染细胞成功。经定量分析,r Ad-GFP组和r Ad-Tum5组的转染效率分别为55.13%和50.31%。Western blot提示Tum5在体外成功表达。CCK-8、Transwell及Matrigel实验结果显示,正常对照组、r Ad-GFP组和r Ad-Tum5组细胞增殖数量、迁移数量及管腔成形数量整体比较,差异均有统计学意义(F=78.914,8.524,226.498,P均0.05)。细胞增殖数量、迁移数量及管腔成形数量组间两两比较结果显示,正常对照组与r Ad-GFP组之间无显著性差异(P均0.05),而r Ad-Tum5组较正常对照组、r Ad-GFP组显著减少,差异有统计学意义(P均0.05)。ELISA结果显示,在腺病毒转染24 h后,三组上清液中VEGF的含量无统计学差异;在转染48 h和72 h后,Tum5组较正常对照组、r Ad-GFP组上清液中VEGF含量显著减少(P均0.05),而正常对照组与r Ad-GFP组相比,细胞上清液中VEGF含量在这两个时点均无显著性差异(P均0.05)。成功构建了大鼠角膜碱烧伤模型,HE结果示:在烧伤后第7天生理盐水组和r Ad-GFP组炎症细胞较r Ad-Tum5组多,烧伤后第14天也是生理盐水组和r Ad-GFP组角膜间质新生血管较r Ad-Tum5多。角膜新生血管面积比较结果示:各组角膜新生血管面积比较,随分组和时间变化均有统计学差异(F分组=2032,p0.01;F时间=1023,p0.01),第一天各组新生血管面积无统计学意义(p0.05),第7天r Ad-Tum5组较生理盐水组和r Ad-GFP组的新生血管面积明显减少,具有统计学意义(p0.05),第14天r Ad-Tum5组较生理盐水组和r Ad-GFP组新生血管面积也是明显减少,仍具有统计学意义(p0.05)。结论腺病毒介导Tum5在体外能够高效转染细胞,并可以成功的表达。能够抑制HUVEC细胞的增殖、迁移和管腔成形。此外,Tum5可以抑制碱烧伤引起的角膜新生血管,其机制可能与下调角膜中VEGF表达有关。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R772.2

【参考文献】