VEGF基因修饰的内皮祖细胞治疗脑梗死的疗效和机制的实验研究

发布时间：2018-11-23 19:54

【摘要】：背景：在中国,每年有约700万脑血病患者,近70%为脑梗死。EPCs既具有干细胞特性,也具有ECs特性,在缺血性疾病中,参与血管生成。EPCs通过参与血管网络结构的重建和生长因子或细胞因子的旁分泌,刺激局部ECs迁移、生长和功能实现,增强脑缺血后神经修复。VEGF在缺血组织中,不仅促进血管新生血管生成,还趋化循环内皮前体细胞归巢到缺血性病灶,并且原位分化血管发生。在MCAO大鼠模型中,EPCs通过趋化因子基质细胞衍生因子1(SDF-1)以及其受体C-X-C趋化因子受体4型(CXCR4)组成的生物轴,参与神经血管新生。组织氧含量降低,HIF-1α上调表达,提供细胞保护和生血管作用。目的：VEGF基因修饰的EPCs治疗脑缺血模型大鼠,探索EPCs和VEGF参与脑缺血的血管新生的效果和机制。方法：通过RT-PCR方法从雄性Wistar大鼠血液的单个核细胞中获取VEGF164,构建pLVX-VEGF164-IRES-ZsGreenl,进行酶切、测序鉴定,及mRNA和蛋白水平上的功能鉴定。采用梯度分离法从雄性Wistar大鼠的骨髓中分离并体外培养EPCs；观察EPCs细胞形态学和免疫荧光染色标记CD133、CD34和PKDR。将携带VEGF的慢病毒载体感染EPCs,获得VEGF基因修饰的EPCs (EPCs-VEGF)。立体定位移植PBS、EPCs和EPCs-VEGF到MCAO模型大鼠的侧脑室。通过mNSS、体重指数等神经功能评估,免疫组织化学染,免疫荧光双染,Tunel染色和Vestern blotting方法分析,比较第1,3,7,14天PBS治疗组和EPCs治疗组的病理变化和治疗效果,并探讨和分析MCAO模型建立第7天时,PBS、EPCs和EPCs-VEGF治疗组中HIF-1α, VEGF, MMP-9, CD34, SDF-1和CXCR4的蛋白表达情况结果：(1)构建了pLVX-VEGF164-IRES-ZsGreenl,在293T细胞中成功包装了携带VEGF164的慢病毒载体,并在mRNA和蛋白水平稳定表达。(2)采用梯度离心,体外培养EPCs,免疫荧光标记CD133, CD34和KDR阳性表达鉴定EPCs。(3)携带VEGF164的慢病毒载体感染EPCs,感染后的EPCs (EPCs-VEGF)绿色荧光表达量70%以上,Western blotting结果EPCs-VEGF的VEGF蛋白表达上调,与EPCs具有统计学差异(P0.05)。(4)PBS和EPCs立体定位注射到MCAO大鼠的侧脑室,两组大鼠在第7天mNSS、体重比有显著差异(P0.01)。免疫组织化学和Western blotting结果显示VEGF在第7天表达量达到高峰,CD34逐渐升高,半暗带区的细胞凋亡随时间延长而改善,而HIF-la在缺血早期高表达,两组间在第3,7,14天存在统计学差异(P0.05)。(5)PBS、EPCs和EPCs-VEGF立体定位注射到MCAO大鼠的侧脑室,第7天的mNSS,体重比,各组间有显著差异(P0.05)。免疫组织化学和Western blotting结果显示VEGF, HIF-1α, CD34, SDF-1和CXCR-4在EPCs-VEGF治疗组表达量最最高,MMP-9在PBS组表达量最大,存在统计学差异(P0.05)。结论：(1)构建了pLVX-VEGF164-IRES-ZsGreen1质粒,并成功包装成携带VEGF的慢病毒载体,慢病毒在RNA和蛋白水平有效表达VEGF。(2)获得骨髓来源的EPCs,并对EPCs进行了鉴定,获得了符合实验要求细胞。(3)成功构建了过表达VEGF164基因的EPCs,通过MCAO模型鼠的治疗,验证了EPCs和VEGF通过HIF-VEGF和SDF-1/CXCR4信号途径,参与大鼠脑梗死的血管新生过程,改善了神经功能,缩小梗死灶体积,促进功能恢复。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743.3

【相似文献】