【摘要】：研制出肉质优良并且高产量的家畜一贯是我们畜牧生产所寻求的目标。传统的杂交育种存在诸多问题,例如周期长,效率低,易变异等。利用转基因技术可在短期内培育出优质的家畜,应用市场十分广泛。高效肌肉特异性启动子能够启动外源基因在骨骼肌细胞中的高效表达,对于提高转基因家畜肉的生产具有重要意义。结蛋白是肌组织中重要的细胞骨架蛋白,是中间纤维主要成分之一,其在肌肉形态的形成与维持、肌细胞的分化凋控、细胞之间的信息传递等诸多方面发挥着重要作用。结蛋白基因启动子可以指导外源基因的特异性表达,但是作为畜牧生产所需的启动子,其转录活性不够,因此利用分子克隆技术对结蛋白基因启动子片段进行改造,我们希望获得一个具有较高启动活性和肌肉组织特异性的启动子。本实验以desmin300启动子为研究对象,通过PCR扩增desmin300中含有多个正调控元件的序列,将其连入desmin300上游,构建含有多个正调控元件的序列的重组启动子;将含有α-actin基因启动子以及Myo G基因启动子的部分调控元件的序列,连到desmin300启动子当中,构建含有两拷贝调控元件的重组启动子;将多拷贝调控元件与desmin300进行串联,构建含有多拷贝调控元件的重组启动子;构建真核表达载体;瞬时转染牛骨骼肌卫星细胞和胎儿成纤维细胞,检测改造后的牛desmin基因启动子的活性和肌肉特异性。具体研究结果如下:1.利用生物信息学分析发现牛结蛋白基因启动子300 bp调控区有3个CTCF、1个CPBP、1个Myo D、2个EGRF、1个AP2、1个Pax3、1个TFIIB、1个Sp1等转录因子调控结合位点。2.应用PCR定点突变的方法,定点突变牛desmin300启动子片段中的CTCF元件,并构建p GL3-desmin300-CTCF质粒,通过荧光素酶报告检测启动子活性发现,突变CTCF元件后,在牛骨骼肌卫星细胞中的突变启动子p GL3-desmin300-CTCF的活性低于野生型单启动子p GL3-desmin300,证明CTCF转录元件为牛desmin启动子的正调控元件。3.我们将野生型启动子p GL3-desmin300以及定点突变后的启动子p GL3-desmin300-CTCF,分别和含有CTCF的外源基因p My-CTCF-GFP共转染。结果表明,突变启动子的活性和其与外源基因共转染后的活性相近,而野生型启动子和外源基因共转染后的活性要明显高于野生型启动子的活性,这证明CTCF元件在结蛋白启动子调控区内与转录因子调控位点相结合并对转录有着正调控作用。4.将含有α-actin基因启动子以及Myo G基因启动子的部分调控元件的序列,连到牛desmin启动子当中,构建重组质粒p GL3-MD-αD(1)-desmin300和p GL3-αD(2)-αD(1)-desmin300。结果表明,p GL3-MD-αD(1)-desmin300和p GL3-αD(2)-αD(1)-desmin300的启动子活性分别是野生型启动子p GL3-desmin300的2.56和2.88倍,说明改造后的启动子片段具有较高的启动活性且具有肌肉特异性。5.我们进一步的又将PCR扩增的含有多个正调控元件的DOUBLE序列连入含有两拷贝调控元件的重组启动子中,结果发现,改造后的重组启动子活性会进一步增强并且仍然具有肌肉特性,重组启动子pGL3-MD-αD(1)-desmin300-DOUBLE3,p GL3-αD(2)-αD(1)-desmin300-DOUBLE3,p GL3-MD-αD(1)-desmin300-DOUBLE2,p GL3-αD(2)-αD(1)-desmin300-DOUBLE2的活性分别是野生型启动子p GL3-desmin300的3.49倍,3.68倍,4.1倍和4.39倍。本研究为转基因家畜肉质性状改良的研究提供更加适合的高效肌肉特异性启动子。
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【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S823
【参考文献】
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2358745
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