人MHC转基因小鼠模型建立及其应用基础研究

发布时间：2018-12-07 14:13

【摘要】：动物模型在疾病致病机制、疫苗和药物的研发评价等临床前试验和基础实验研究中发挥了重要作用。但现有动物模型仍存在一定的局限性,如小鼠和非人灵长类动物,在遗传背景、生理及免疫状态上均与人类存在着差异,尤其是MHC限制性的差别,无法消除种属特异性的影响,难以准确反应人类免疫特征,导致许多临床前动物实验结果与人体临床反应迥异。此外,免疫缺陷小鼠NOD/SCID小鼠等尽管在移植和肿瘤免疫等研究中得到应用,但由于小鼠H-2与人HLA限制性的差异,仍存在着免疫排斥及移植效率低等问题。因此,如何培育出人源化程度更高、能够更加有效模拟人类免疫反应的动物模型是目前人源化动物模型研究亟待解决的关键科学问题之一。MHC是广泛存在于人类和哺乳动物中多态性最为丰富的基因之一,参与T细胞在胸腺中的选择,发挥限制性作用调节免疫应答等。小鼠和人类的MHC在结构和功能上虽十分相似,但其MHC免疫限制性功能却完全不同。人MHC优势基因型分布存在种族差异,中国人群与欧美、中东及其他地区MHC优势基因型有显著差异。中国人群HLA-I类优势亚型以HLA-A2、A11和A24为主,而欧美人群则主要是A2、A1和A3等;中国人群HLA-II类分子优势亚型主要是DR09、DR15和DR01等,而欧美及中东人群则以DR01、DR03和DR04为主。人MHC转基因小鼠模型是通过将HLA转入小鼠基因组中,同时敲除小鼠H-2的重要组分,从而排除H-2对外源HLA的竞争性抑制,能够更加准确、有效的反应HLA作用特征。本课题旨在构建能够体现中国人群优势MHC基因型的HLA-A11/DR1双转基因小鼠模型并以此为基础进行疫苗的评价和新发病原表位鉴定等实验研究;构建和培育人MHC免疫缺陷小鼠模型HUMAMICE(HLA-A2+/+/DR1+/+/H-2-β2m-/-/IAβ-/-/Rag2-/-/IL-2rγ-/-/Perf-/-),建立人源细胞移植免疫重建小鼠模型,为病原感染模型研究、肿瘤和移植免疫机制研究及疫苗、药物评价等提供技术支撑。1.人MHC(HLA-A11/DR1)双转基因小鼠模型建立及其应用基础研究1.1 HLA-A11/DR1小鼠模型建立及免疫功能分析:构建包含HLA-A11启动子、轻链β2m,重链α1和α2、H-2-Db的α3和跨膜区的HLA-A11嵌合转基因载体,通过显微注射导入小鼠受精卵中,胚胎移植后获得HLA-A11转基因首建鼠;选择A11表达量最高的转基因首建鼠与HLA-A2/DR1小鼠进行杂交,构建稳定遗传的HLA-A11+/+/DR1+/+H-2-β2m-/-/IAβ-/-小鼠;鉴定到HLA在小鼠基因组中的整合及H-2的敲除;检测到HLA在A11/DR1小鼠脾细胞表面的表达显著强于C57BL/6及全阴小鼠;HLA-A11/DR1小鼠体内检测到相对正常数量的CD8+和CD4+T细胞,说明HLA能够满足淋巴细胞在胸腺中完成选择,发育为成熟的t淋巴细胞;利用已知hla-a11表位hiv-pol177-188和hiv-gp16032-45能特异性刺激a11/dr1小鼠产生hla-a11限制性ctl反应,证明a11/dr1小鼠具有hla-a11限制性免疫反应功能。1.2hla-a11/dr1小鼠模型在疫苗研发及评价中的应用(1)hla-a11/dr1小鼠模型在疫苗免疫评价中的应用:将商业化疫苗啤酒酵母基因工程乙肝疫苗和新型疫苗hiv-mep1作为模式抗原,免疫后小鼠血清中特异性igg抗体均显著上升;elispot检测表明以hiv-mep1和hiv-1多肽刺激,均产生了高水平的特异性细胞免疫;在hbsag疫苗的刺激下,a11/dr1小鼠产生的ifn-γ是c57bl/6小鼠的3-4倍。证明hla-a11/dr1小鼠在特异性抗原的刺激下产生了良好的体液和细胞免疫,能应用于疫苗的免疫评价中,尤其适用于细胞免疫反应的评价。(2)以hla-a11/dr1小鼠模型为基础的hla-a11限制性ctl表位筛选鉴定:通过生物信息学技术综合预测和分析了24个ebovgp蛋白和mers-covs蛋白与hla-a11结合力较强的候选表位。利用hla-a11/dr1小鼠验证和鉴定得到2个ebov-gp(ebov-gp76-84和ebov-gp423-431)和4个mers-cov-s(mers-s152-160、mers-s720-728、mers-s889-897和mers-s1092-1100)的hla-a11限制性表位肽。实验表明该转基因小鼠模型可有效进行病原表位筛选和鉴定。2.人mhc免疫缺陷小鼠(humamice)的建立及人源细胞移植小鼠模型研究2.1humamice的建立及免疫缺陷功能分析(1)humamice的制备及鉴定:将hla-a2/dr1小鼠(hla-a2+/+/dr1+/+/h-2-β2m-/-/iaβ-/-)与rag2-/-小鼠、il-2rγ-/-小鼠和perf-/-小鼠进行杂交繁殖,获得人mhc免疫缺陷小鼠humamice(hla-a2+/+/dr1+/+/h-2-β2m-/-/iaβ-/-/rag2-/-/il-2rγ-/-/perf-/-)。鉴定了hla的整合,h-2-β2m、iaβ、rag2、il-2rγ和perf的敲除及稳定遗传,检测到a2特异性表达;humamice体内未检测到cd3+cd4+、cd3+cd8+和cd19+cd20+细胞,表明在rag2、il-2rγ和perf缺陷的共同作用下,humamicet、b及nk细胞缺失。(2)humamice的免疫缺陷功能分析:取humamice和a2/dr1小鼠的免疫器官进行he染色,发现humamice的脾脏萎缩、胸腺发育不全,脾小体和胸腺小叶结构不完整甚至缺失,a2/dr1小鼠则具有结构正常的胸腺和脾脏。将ramos皮下接种以上两种小鼠,30天后,humamice均产生肿瘤,而a2/dr1小鼠则未发生肿瘤。向已发生肿瘤的humamice过继回输a2/dr1小鼠(接种ramos后未发生肿瘤)的脾细胞、cd8+t及其他免疫细胞,均能在一定程度上使humamice的肿瘤变小。结果表明humamice的免疫器官发育不成熟、免疫功能缺陷,移植肿瘤细胞后能够成瘤,能够支持肿瘤模型的建立。2.2humamice人源细胞移植和免疫重建特征分析(1)人源细胞(hpbmc)移植humamice及其免疫反应功能分析:筛选获得hla-a2+/dr1+pbmc样本;在小鼠全身辐射处理后的24h内进行人源细胞移植,10天后用hbsag疫苗免疫小鼠。在humamice进行hla匹配的hpbmc移植的60天内,实验组的体重较对照组并未显著下降,说明在humamice进行人源pbmc移植后并未发生gvhd反应。hbsag疫苗免疫humamice后,血清中hbsag特异性igg人源抗体在加强免疫后显著上升,igm人源抗体则在二免时达到顶峰。(2)humamice人源细胞移植后的免疫重建效率的分析:在人源细胞移植后的第五、八周,检测发现humamice脾细胞中hcd45+t细胞占11.6%和9.70%,其中hcd45+hcd19+占45.2%和49.4%,hcd45+hcd3+占17.1%和16.1%,hcd3+hcd8+占hcd45+hcd3+的29.0%和30.0%、hcd3+hcd4+占hcd45+hcd3+的60.9%和59.0%。结果表明,humamice在进行hla-a2+/dr1+pbmc移植后,脾脏中发现人源细胞,其免疫系统获得重建。3.研究结论(1)本研究成功建立和培育了具有中国人群hla优势基因型的hla-a11/dr1(hla-a11+/+/dr1+/+/h-2-β2m-/-/iaβ-/-)双转基因小鼠模型,该转基因小鼠模型具有人mhc免疫限制性特征及正常的免疫应答功能,疫苗评价实验表明该模型可以有效地应用于疫苗免疫评价研究中。利用该小鼠模型开展了重要病毒新型表位的预测、筛选和鉴定,获得两个位于ebovgp蛋白和四个mers-covs蛋白中的hla-a11限制性ctl表位。上述研究表明该人mhc双转基因小鼠模型能够有效应用于针对中国人群的重要病原体hla限制性ctl和th表位的筛选和鉴定等研究中。本研究建立的人mhc双转基因小鼠模型为免疫限制性机制研究、疫苗的研发和评价等提供了一种新的技术手段。(2)本研究成功建立和培育了人mhc免疫缺陷小鼠模型humamice(hla-a2+/+/dr1+/+/h-2-β2m-/-/iaβ-/-/rag2-/-/il-2rγ-/-/perf-/-)。该小鼠模型不仅具有人mhci类及ii类分子限制性特征(即hla-a2和hla-dr1限制性),而且其t、b及nk细胞缺失,脾脏和胸腺发育不完全;在进行人源细胞(hla-a2+/dr1+pbmc)移植的三个月内humamice未发生gvhd反应,移植后小鼠脾细胞中检测出人源cd45+细胞(hcd3+cd8+、hcd3+cd4+)。移植后humamice小鼠免疫hbsag疫苗后,能够诱导产生特异性igm和igg人源抗体,表明该人mhc免疫缺陷小鼠模型的免疫系统获得了人源化重建。人mhc免疫缺陷小鼠模型(humamice)为病原感染动物模型的建立、人源抗体制备和药物评价等研究提供了一种新型免疫实验研究模型。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R-332

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