团头鲂MHC Ⅱα基因的SNP位点开发、鉴定及与抗病性状关联分析

发布时间：2018-12-11 08:41

【摘要】：团头鲂(Megalobrama amblycephala)是我们国家在淡水养殖鱼类中占有举足轻重地位的一个优良品种,近些年,由于养殖规模的扩大化,养殖环境的恶化,集约化养殖程度的大幅度提高,各类疾病频发。其中,对团头鲂影响最大的就是由嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染引起的细菌性败血症,可导致鱼体大量死亡。目前,还没有快速有效的方法对其进行预防和治疗。本研究用嗜水气单胞菌感染团头鲂区分抗病和易感组,通过PCR扩增及测序在MHC Ⅱα基因上筛选单核苷酸多态位点(Single nucleotide polymorphisms,SNP),利用高分辨率溶解曲线法和限制性内切酶酶切法对SNP进行分型,分析其多态性及与抗病性状之间的关系。在MHC Ⅱα基因上共筛选出35个候选SNP位点,占MHC Ⅱα基因总碱基的1.45%,包含30个转换位点,5个颠换位点。其中外显子部分有16个,内含子部分7个,5'非编码区有1个,3'非编码区有11个。有13个SNP位点位于编码区,占总氨基酸位点的5.56%,位于839 bp的T/A颠换和1663 bp的A/G转换是无义突变,其余11个SNP位点为有义突变。MHC Ⅱα基因的21个抗原结合位点(Peptide binding region,PBR)中,有4个位点变异,变异率为19.05%;而non-PBR的变异率仅为8.20%(5/61)。结果证实团头鲂MHC Ⅱα基因含有丰富的多态位点、具有极高的特异性且对蛋白质的结构和功能产生了一定影响。α1结构域的SNP位点分别占总碱基和总氨基酸位点的4.88%和10.98%,明显高于α2结构域的1.08%和3.22%。这是由于α1结构域存在的抗原肽结合区具有高度的多态性,再次证实PBR位点存在于α1结构域。表明抗原结合位点区域的多态性高于非抗原结合位点的多态性,同时也表明氨基酸的替代、替换集中出现在多肽结合位点上。NJ(Neighbor-joining)法构建的系统进化树中,团头鲂MHC Ⅱα基因和数量众多的硬骨鱼类集聚成为一个分支,侧面说明了硬骨鱼类应该是单系起源的;另外,硬骨鱼又一分为二,团头鲂和别的鲤科鱼类分了一支,鲑鳟鱼类为另外一支,二者独自进化,互不影响。由此可见,团头鲂与鲤科鱼类中的草鱼(Ctenopharyngodon idella)关系最近,与斑马鱼(Danio rerio)、建鲤(Crprinus carpio jian)的关系稍远,与大西洋鲑(Salmo salar)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)的关系较远,与其他脊椎动物、哺乳动物的关系最远。对分型成功的5个SNP位点在易感和抗病组中各100尾鱼的基因型频率和等位基因频率进行了统计。通过卡方检验分析发现位于1395 bp(T/A)位点的基因型频率和等位基因频率在易感和抗病组中差异极显著(P0.01),位于221bp(G/T)和1859 bp(G/T)位点的基因型频率和等位基因频率在易感组和抗病组中差异显著(P0.05)。其中位于第三外显子1395bp(T/A)位点的突变导致天冬氨酸转变为谷氨酸,引起了蛋白质结构和功能的改变,进而改变了鱼体的抗病性。位于5'非编码区221bp(G/T)位点和位于3'非编码区1859bp(G/T)位点的突变没有导致氨基酸改变,但实验结果却显示与抗病关联。本研究结果表明团头鲂MHC Ⅱα基因的多态性和抗细菌性败血症性状显著关联,进一步分析表明,纯合个体对嗜水气单胞菌引起的细菌性败血病抗性更高。本实验初步分析获得的相关SNP标记及相应的优势、劣势基因型,能够在进行团头鲂抗病育种工作时为亲本的选择提供理论依据,也为分子遗传标记和团头鲂抗病基因筛选奠定理论基础。
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【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4

【参考文献】