基因标志物数字化检测新方法研究

发布时间：2018-12-13 17:09

【摘要】：随着生物医学的快速发展,基因标志物在现代医学中的意义越来越重要,研究已经发现众多与疾病的发生、发展等密切相关的基因标志物,包括基因多态性、体细胞突变、拷贝数变异以及基因甲基化水平异常等。通过检测这些基因标志物,我们能够实现对疾病的发病风险预测、早期诊断、疗效监测以及预后评估等。然而,由于基因标志物往往具有丰度低、序列差异小等特点,要求检测方法具有较高的灵敏度、特异性及良好的定量性能,常规方法有时难以进行准确的检测。数字化PCR技术是近年来发展的一种基于单分子PCR的新一代核酸定量检测方法。其基本原理是将靶标分子分散到一个个微小体积的反应单元中,使每个反应单元中所含有的靶标分子数目不超过1个,在每个反应单元中独立进行单分子PCR扩增反应,反应结束后对每个反应单元进行检测,可以实现对初始核酸靶标的绝对定量。数字化PCR技术在定量精确度、准确性和灵敏度等方面均优于传统的实时荧光定量PCR方法,在核酸检测中发挥着越来越重要的作用。本课题在前期研究基础上,利用数字化PCR方法结合水凝胶微球阵列技术,实现了对粪便DNA中大肠癌相关的VIM基因甲基化水平异常的高灵敏、高特异性定量检测,有望应用于基于粪便DNA检测的大肠癌无创筛查中。然而,PCR扩增是一种基于模板扩增的方法,反应产生大量与模板分子序列一致的扩增产物,这些扩增产物可以作为下一次扩增反应的模板。因此,微量的"遗留扩增产物"污染就会导致假阳性结果的出现。核酸信号放大方法是一种通过模板分子触发信号分子扩增的反应,不同于PCR、LAMP等模板扩增方法,在反应过程中模板分子本身的数量并没有变化,而是靶标特异性的信号分子被循环放大,因此是避免扩增产物污染的理想方法。本课题在前期研究基础上,提出将信号放大反应与数字化检测相结合进行单分子计数检测的新思路。首先采用可区分单碱基序列变化的结构特异性核酸侵入信号放大反应,将待测靶标放大并转化为与模板序列无关的信号分子;再通过级联反应将扩增的信号分子进一步放大,产生放大百万倍以上的荧光信号分子,该荧光分子与靶标序列无关,但特异于靶标分子。为了实现基于核酸侵入反应的单分子数字化检测,我们对目前核酸侵入反应存在的问题进行了改进。首先是如何提高核酸侵入反应对单碱基差异的识别特异性。理论上核酸侵入反应能够识别侵入结构处的单个碱基差异,然而对不同位点的检测过程中发现,有些位点的检测存在非特异性反应信号,导致难以准确检测单碱基差异。对此,我们提出在核酸侵入反应的下游探针中人为引入错配碱基。通过优化错配碱基的位置及错配碱基类型,显著降低非特异性信号,提高了核酸侵入反应对单碱基差异检测的特异性。其次,在常规的级联核酸侵入反应中,下游探针会和荧光发卡探针形成一种称为"X"型结构的非特异性结构。这种结构同样能够被FEN1核酸内切酶识别和切割,产生背景信号。在进行低拷贝靶标的检测时,靶标分子产生的阳性信号较弱,此时背景信号会对检测结果造成严重影响,使阳性结果和阴性结果无法有效区分。为了降低核酸侵入反应中"X"型结构产生的背景信号,我们提出了一种可控延伸反应介导的新型级联核酸侵入反应原理。该方法中,通过在下游探针和荧光探针的杂交序列之间引入一段间隔序列,避免"X"型结构的形成,显著降低背景信号。两步核酸反应通过一种可控延伸反应进行桥联,形成信号放大。由于背景信号被抑制,阳性信号与背景信号区分明显,相比于常规核酸侵入反应方法,检测灵敏度提高约40倍,可利用该方法进一步建立单分子水平的核酸侵入反应。最后,我们将所建立的基于可控延伸反应的低背景级联核酸侵入反应应用到微球-微乳相数字化扩增检测体系中,显著降低了阴性反应单元中的背景信号。利用所建立的基于微球-微乳相体系的低背景级联核酸侵入反应,初步实现单分子信号扩增数字化检测,阳性反应单元信号与阴性反应单元的背景信号有明显的区分。我们所建立的基于信号扩增的数字化检测方法有望成为一种高灵敏、高特异、无污染的核酸数字化检测新方法。
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【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R3416

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