细菌漆酶基因挖掘、酶学特性及其结构研究

发布时间：2018-12-19 21:38

【摘要】：漆酶(Laccase,EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶,属于蓝色多铜氧化酶(MCOs)家族,其底物包括一大类酚类、非酚类化合物。漆酶的催化氧化过程包括夺取反应底物的电子,活性中心的铜离子间的协同电子传递,最后将电子传递给O2使其还原为水。由于漆酶底物的广泛性,使得漆酶在纺织工业、纸浆造纸、食品工业、生物传感器等领域有重要的应用价值。因此,获得具有优良特性和高活性的漆酶具有重要价值。而相比于真菌漆酶,细菌漆酶往往具有耐高温、耐高碱和耐高盐等优势。本论文通过基因组数据库挖掘技术挖掘得到3个新细菌漆酶,分别命名为LacTT、Lac CT和Lac BE,其中LacTT有较好的酶学特性。为了获得LacTT的大量表达,本论文选择毕赤酵母对LacTT进行过量分泌表达,并对其酶特性及其对工业染料的脱色性能进行研究。此外,通过同源建模和定点突变技术对LacTT的底物结合和电子传递的关键氨基酸及其作用机制进行研究。主要研究内容和结果如下:(1)本研究通过基因组数据库挖掘技术从Gen Bank中挖掘得到3个未经报道的新细菌漆酶,分别来源于Thermus thermophilus SG0.5JP17-16、Caldalkalibacillus thermarum TA2.A1和Bacillus endophyticus(LacTT、Lac CT和Lac BE)。通过对3个细菌漆酶的最适温度和最适pH的研究发现:LacTT具有最高的反应温度(90℃)和较宽的反应pH,其在高温、pH中性和碱性条件下具有较高酶活力;Lac BE则有较宽的反应温度和pH,但是它的最适pH偏酸性;而Lac CT尽管表现出最高的最适pH,但是它的反应温度和pH范围都比较窄。而且,LacTT的纯化结果表明它易于纯化。LacTT的酶学特性研究表明它具有较高的应用潜力。(2)本研究构建了毕赤酵母重组漆酶LacTT高效表达体系,在摇瓶培养条件下,最大漆酶表达量达到709 U/L。重组LacTT的酶学特性分析表明:重组LacTT在中性和碱性条件下具有比较高的活力和稳定性,而且具有高温活性和很高的热稳定性,最适温度高达90℃,在90℃下的半衰期约4 h。LacTT对卤化物的耐受性超过其它大多数的漆酶,而且,在1 M浓度范围内,NaCl和NaBr对LacTT的酶活力有不同程度的提高。重组LacTT对4种工业染料的脱色率介于73%-94%,而且,Na Cl可以提高LacTT的脱色效率。因此,LacTT在纺织染料废水脱色方面具有较高的应用潜力。(3)本研究基于序列比对、同源建模和定点突变技术,对LacTT的底物结合域附近的三个极性带电荷的氨基酸K428、R290和D394及其作用机制进行研究。同源建模结构表明LacTT具有酶蛋白空间结构和活性中心结构的保守性。K428、R290和D394的突变体在600 nm和330 nm处的特征吸收峰较野生型有所差异,说明突变位点对LacTT的铜中心位点的结构都有一定扰动。K428M酶活力较野生型LacTT有所提高,而R290A、R290H、D394A、D394R的酶活力较野生型有所降低,表明:K428、R290和D394对LacTT的酶催化活性有显著的影响。K428M的k_(cat)/K_m值约为野生型的2倍,K_m值约为野生型的1/2,表明K428M酶催化效率的提高是因为突变体与底物的亲和力增大。突变体R290A和R290H的酶活力较野生型有所降低,D394A和D394R酶活力也几乎丧失,而对它们的底物结合常数和空间结构的分析结果推测:LacTT的R290和D394的侧链与底物之间存在相互作用,在突变之后可能这种作用力消失,从而影响了底物结合甚至是酶对底物的催化效率。(4)基于序列比对、同源建模和定点突变技术,对LacTT的酸性氨基酸D106、E456、E356和D423及其作用机制进行研究。D106、E456、E356和D423的突变体在600nm和330nm特征吸收峰值较野生型有所差异说明突变点对铜中心位点结构都有较大扰动。D106L、D106R、D106E的k_(cat)/K_m值只有野生型的20%-30%,推测因为它们的第106位残基侧链不能与T2Cu形成正确的水分子网络,导致TNC中氧还原的受阻,引起催化活力下降。突变体E456L、E456R、E456D的酶催化活力几乎丧失,是因为第456位的残基侧链不能正常向TNC提供质子,使得TNC中氧的还原反应无法正常进行。位于T1Cu附近的E356A的k_(cat)/K_m值只有野生型的7%,K_m值是野生型的3.8倍,结合空间结构研究,推测E356位点能接受来自底物的质子,而且对酶与底物的结合起重要作用。D423A的k_(cat)/K_m值仅为野生型的一半,推测D423对TNC中氧的还原有重要影响。所以,D106、E456、E356和D423都是参与LacTT电子传递的关键氨基酸,而且,E356和D423位点是在细菌漆酶中首次发现对电子传递有重要影响的氨基酸残基。(5)我们对漆酶LacTT的电子传递机制推测如下:在还原底物被氧化时,底物的电子被T1Cu的配体组氨酸夺取,同时E356接受底物氧化所产生的质子。T1Cu配体的组氨酸将来自底物的电子传递给T1Cu,随后电子通过Cu-S(Cys)-N(His)三联体传递至TNC,在氧还原的过程中,E456向TNC提供质子,而D106和D423则协助TNC中O-O键的断裂,将结合在TNC上的分子氧还原成水。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q55;Q78

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