草鱼pIgR基因克隆表达及与IgM结合活性的研究

发布时间：2018-12-25 14:50

【摘要】：黏膜免疫作为免疫的第一道防线,能够起到识别和中和病原,诱导免疫细胞吞噬病原等重要作用。多聚免疫球蛋白受体pIgR(polymeric immunoglobulin receptor)是脊椎动物黏膜免疫中的重要分子,在鱼类免疫中发挥重要作用。草鱼(Ctenopharyngodon idellus)作为重要的经济鱼类,易受病原侵袭而患病。免疫是防控疾病发生的有效方法,但对鱼类免疫的分子机制仍不够清楚。本文通过研究pIgR基因克隆、表达分析及与IgM的结合活性,旨在为提高草鱼免疫防控水平提供理论依据。本研究采用RT-PCR、3’-RACE和5’-RACE技术方法扩增得到草鱼pIgR的cDNA序列,通过序列拼接,获得pIgR全长序列,草鱼pIgR全长1667 bp,含有一个1008 bp的开放阅读框(Open reading frame,ORF)。编码336个氨基酸,5’非编码区长度为77 bp,3’非编码区长度为579 bp。草鱼pIgR蛋白由胞外段、跨膜段、胞内段三部分组成,推测分子量为37.22kDa,前端由22个氨基酸组成信号肽,胞外段包括有两个ILD结构域。采用RT-qPCR方法,研究草鱼皮肤、肌肉、鳃、肝脏、脾脏、肠、头肾和心脏中pIgR mRNA水平表达差异,结果显示肠中pIgR mRNA表达水平最高,其次是脾脏,肝脏、头肾和肌肉中表达量较少。采用原核表达载体pET-32a,表达草鱼pIgR蛋白;利用Rosetta大肠杆菌表达系统,大量诱导表达重组pIgR蛋白。纯化重组表达的pIgR蛋白,将其免疫小鼠制备其特异性抗体。构建pcDNA3.1-pIgR真核表达载体,然后转染至草鱼卵巢细胞系GCO(Grass carp ovary)中,使用本研究制备的鼠抗草鱼pIgR抗体作为一抗,FITC标记的羊抗鼠抗体作为二抗,利用免疫荧光法检测到草鱼pIgR蛋白表达。并使用草鱼天然IgM以及兔抗草鱼IgM的抗体,在转染pcDNA3.1-pIgR的细胞中检测到pIgR和IgM的结合。
[Abstract]:As the first line of defense, mucosal immunity can recognize and neutralize the pathogen and induce immune cells to phagocytosis. Polyimmunoglobulin receptor (pIgR (polymeric immunoglobulin receptor) is an important molecule in vertebrate mucosal immunity and plays an important role in fish immunity. As an important economic fish, grass carp (Ctenopharyngodon idellus) is susceptible to pathogens. Immunization is an effective method to prevent and control diseases, but the molecular mechanism of fish immunity is still unclear. In this paper, the cloning, expression analysis and binding activity of pIgR gene with IgM were studied in order to provide theoretical basis for improving the immune control level of grass carp. In this study, the cDNA sequence of grass carp pIgR was amplified by RT-PCR,3'-RACE and 5'-RACE techniques. The full-length pIgR sequence was obtained by sequence splicing. The full-length pIgR 1667 bp, contained an open reading frame (Open reading frame,ORF (1008 bp). Encoding 336 amino acids, 5 'non-coding region is 77 bp,3', non-coding region is 579 bp.. The pIgR protein of grass carp is composed of three parts: extracellular, transmembrane and intracellular, and its molecular weight is 37. 22 kDa. The front end consists of 22 amino acids, and the extracellular domain consists of two ILD domains. The expression of pIgR mRNA in skin, muscle, Gill, liver, spleen, intestine, head kidney and heart of grass carp was studied by RT-qPCR. The results showed that the expression of pIgR mRNA in intestine was the highest, followed by spleen and liver. There is less expression in head kidney and muscle. The prokaryotic expression vector pET-32a, was used to express the pIgR protein of grass carp and the recombinant pIgR protein was expressed in large quantities by using the Rosetta Escherichia coli expression system. The recombinant pIgR protein was purified and immunized to prepare its specific antibody. The eukaryotic expression vector of pcDNA3.1-pIgR was constructed and transfected into grass carp ovarian cell line GCO (Grass carp ovary). The mouse anti-grass carp pIgR antibody was used as the first antibody, and the FITC labeled goat anti-mouse antibody was used as the second antibody. The expression of pIgR protein in grass carp was detected by immunofluorescence. The binding of pIgR and IgM was detected in pcDNA3.1-pIgR transfected cells using natural grass carp IgM and rabbit antibody against grass carp IgM.
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4

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本文编号：2391275