自噬相关基因mTORC1、mTORC2及Beclin1与大肠癌耐药及靶向治疗分子机制的相关研究

发布时间：2019-02-15 11:58

【摘要】：目的检测自噬调控基因mTORC1、mTORC2、Beclin1与多药耐药基因MDR-1在大肠癌患者癌组织中的水平,分析自噬对大肠癌多药耐药的影响;以人结直肠癌耐药细胞株HCT-8/5-FU为研究对象,研究大肠癌中自噬调控基因mTORC1,mTORC2及Beclin1的表达对大肠癌耐药的影响及其机制,探讨mTORC1,mTORC2及Beclin1对大肠癌靶点治疗及其化疗的协同影响作用。材料与方法收集滨州医学院附属医院病理科2006年01月至2010年01月手术治疗的279例大肠癌患者组织和资料,所有患者都是首次发现,术前没有进行任何治疗,术后所有患者进行了联合治疗。通过回访中心和电话对所有病例进行随访。应用免疫组化Envision法检测279例大肠癌中mTORC1、mTORC2核心分子Raptor和Rictor以及mTOR、Beclin1、LC3和MDR-1的表达,采用χ2检验分析各蛋白与临床病理参数的相关性;运用Kaplan-Meier统计学方法探讨结直肠癌患者预后的影响因素。使用慢病毒转染技术抑制HCT-8/5-FU细胞株中Beclin1的表达,分别用雷帕霉素、KU0063794和5-FU联合干预HCT-8/5-FU细胞株,分别用RT-PCR和Western blot实验在RNA和蛋白水平检测各组细胞LC3-II、NF-kB、MDR-1、Bcl-2、Bax、MDR-1、Cleavage Caspase-3、CyclinDl 的表达,平板克隆实验、CCK-8检测细胞增殖活性,Transwell评估肿瘤侵袭能力,MDC染色显示自噬水平,Hoechst33342检测细胞凋亡。选择健康BALB/c裸鼠,皮下种植瘤细胞,观察裸鼠成瘤情况,每天腹腔注射雷帕霉素、KU0063794及5-FU, 4周后处死裸鼠后取移植瘤分析,并且分别用免疫组化、RT-PCR和Western blot实验在RNA和蛋白水平检测移植瘤组织中MDR-1、LC3-Ⅱ, NF-kB的表达。结果大肠癌标本中Beclin1、LC3、mTOR、Raptor、Rictor和MDR-1的阳性率分别为 90.32%、87.09%、46.23%、42.65%、62.72%和 72.75%,较正常组织均增加。LC3蛋白在中+低分化大肠癌中的表达高于高分化大肠癌,mTOR、Raptor、Rictor、LC3在淋巴结转移组的表达高于无淋巴结转移组;Beclin1水平升高与分化程度和淋巴结转移均无明显相关性。LC3和Beclin1、Rictor水平具有正相关性,与Raptor、mTOR水平具有负相关性,Beclin1与mTOR水平无明显相关性。Raptor与Rictor的水平具有负相关性。MDR-1与Beclin1、LC3和Rictor的表达呈正相关表达,而Raptor与mTOR的表达呈负相关。Kaplan-Meier生存分析显示,Rictor、Beclin1、LC3均阳性,Raptor、mTOR、MDR-1均阴性,并且无淋巴结转移的大肠癌患者五年生存率大于Rictor、Beclin1、LC3均阴性,Raptor、mTOR、MDR-1均阳性及淋巴结转移。干扰RNA有效抑制了 Beclin1基因在mRNA和蛋白水平的表达,并且显著下调了 Bax、LC3-II和CleavageCaspase-3的表达,上调了 Bcl-2的表达。此外,抑制Beclin1分别在体外和体内明显增加了肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭活性,减弱了肿瘤细胞凋亡活性,并且肿瘤细胞对5-FU的敏感性显著降低。KU0063794有效抑制了 mTORC1和mTORC2,并且显著上调了 LC3-II的表达,下调了NF-kB,MDR-1和CyclinD1的表达。此外,同时抑制mTORC1和mTORC2分别在体外和体内明显降低了肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭活性,增强了肿瘤细胞凋亡活性,并且肿瘤细胞对5-FU的敏感性显著增高。结论1 Beclinl、Raptor与Rictor在大肠癌组织中水平升高,与大肠癌发生、发展、转移及生存密切相关,对于判断大肠癌患者的预后具有重要参考价值。2.大肠癌中MDR-1的表达与Beclin1、LC3、Raptor、Rictor密切相关;检测Beclin1、Rictor、Raptor蛋白表达,可为判断大肠癌的多药耐药以及合理筛选有效的化疗药物提供新的理论依据。3.抑制自噬调控基因mTORC1、mTORC2的表达、增加Beclin1的表达可以降低肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭活性,增强肿瘤细胞的凋亡,从而抑制肿瘤的发生发展。4.靶向抑制mTORC1、mTORC2、上调Beclin1可逆转肠癌细胞的耐药性,可增加大肠癌靶点治疗及常规化疗的协同作用,对于提高大肠癌的临床治疗效果具有重要意义。
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【学位授予单位】：滨州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.34

【参考文献】