SIK2基因敲除鼠模型的建立及其功能研究

发布时间：2019-02-25 17:32

【摘要】：通过构建SIK2基因敲除小鼠模型,进一步从体内研究SIK2蛋白的功能。主要包括SIK2在电离辐射损伤、免疫及免疫损伤修复和T细胞抗原受体(TCR)基因重排这几方面的功能,为SIK2功能的深入研究打下坚实的基础。构建带有两个Loxp位点的ES细胞打靶载体,转染ES,通过同源重组将两个Loxp位点整合进基因组中SIK2基因的第2、3号外显子两边的内含子上,筛选带有两个Loxp位点的阳性ES克隆,将阳性ES克隆显微注射囊胚腔内,随后移植于假孕雌鼠子宫中,待嵌合体小鼠SIK2LoxPl-2+/-出生,嵌合体小鼠经纯化后与EⅡα-Cre+/+工具鼠杂交,筛选SIK2Loxp1-2+/-Cre+/-鼠,该小鼠与WT型小鼠杂交,筛选SIK2Loxp3+/-Cre-/-(SIK2+/-)鼠,再将SIK2+/-基因型小鼠雌雄杂交,筛选SIK2-/-基因型小鼠。随后,利用SIK2+/+(WT)与SIK2+/-(KO)小鼠进行功能研究。WT与KO小鼠分别给予8 Gy60Coγ射线一次性全身照射,每天观察记录其生长存活情况,并计算各自在30天内的存活率。取SIK2+/-基因型的小鼠雌雄杂交,取孕13.5天雌鼠胚胎分离MEFs细胞,通过克隆形成实验观察二者的辐射敏感性差异。通过血常规分析WT与KO小鼠红细胞、白细胞、血小板及血红蛋白含量,并进行骨髓有核细胞计数,观察SIK2敲除对造血功能的影响。利用流式细胞术检测WT与KO小鼠外周血、胸腺、骨髓和脾组织中免疫细胞的比例数量,对T、B细胞亚群进行分析,并结合组织切片HE染色观察各免疫组织病理结构变化,研究小鼠SIK2基因敲除对其免疫力的影响。取SIK2+/+与SIK2+/-小鼠胸腺组织,提取胸腺细胞DNA,设计针对TCRβ位点Vβ8-Dβ2Jβ2重组片段的特异性探针,通过Southern blot技术检测WT与KO小鼠TCRβ位点V(D)J重组是否存在差异。结果显示,成功筛选到了阳性ES克隆,通过显微注射及囊胚移植,获得了SIK2 LoxPl-2+/-嵌合体小鼠。该嵌合体小鼠经纯化后与EⅡα-Cre+/+工具鼠杂交,筛选得到SIK2Loxp1-2+/-Cre+/-鼠,该小鼠与WT型小鼠杂交,获得了SIK2Loxp3+/-Cre-/-(SIK2+/-)鼠,再将SIK2+/-基因型小鼠雌雄杂交,未筛选到SIK2-/-基因型小鼠,由于SIK2敲除后导致胚胎致死。小鼠存活率实验及克隆形成实验结果显示,SIK2基因敲除小鼠及MEFs细胞的辐射敏感性增强。血常规分析表明KO小鼠红细胞、白细胞、血小板及血红蛋白含量均显著低于WT。骨髓有核细胞计数结果显示,KO小鼠骨髓有核细胞数明显少于WT。流式结果表明,KO胸腺中CD4+CD8-、CD4-CD8+T细胞含量显著减少,CD4+CD8+T细胞含量显著增加;外周血中CD3+T细胞含量减少,CD4+CD8-、CD4-CD8+T细胞含量减少,而不成熟的CD4-CD8-T细胞含量显著增多;骨髓中IgM+B220+和B220+CD43-B细胞含量有所减少;脾脏中成熟的CD4+CD8-、CD4-CD8+单阳性T细胞含量及IgM+B220+B细胞含量显著减少。组织切片HE染色观察发现,SIK2+/-小鼠胸腺、脾和骨髓的病理组织结构与SIK2+/+相比无显著改变。但在照射后,SIK2+/-小鼠胸腺、脾和骨髓各项指标显示,其比WT损伤的更为严重,损伤恢复更加缓慢。最后,我们还发现SIK2+/-小鼠胸腺细胞DNA中未能检测到TCRβ位点V8-D2J2基因片段。实验表明利用Cre-LoxP重组酶系统成功构建了SIK2基因敲除小鼠,但暂未得到SIK2-/-完全敲除的小鼠,存在胚胎致死现象。SIK2基因敲除后小鼠及MEFs细胞的辐射敏感性增强;造血功能减弱;小鼠淋巴细胞发育成熟受阻;辐射引起的免疫系统损伤修复减弱;小鼠TCRβ位点V-DJ基因重排失败。
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【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78

【参考文献】