特异性敲除肾小管MyD88基因对急性肾损伤的影响研究

发布时间：2019-02-28 19:58

【摘要】：目的:急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)是一种临床常见病,特别是药物性急性肾损伤发病率更高,并有继续升高的趋势,且死亡率高,也是引起慢性肾脏疾病的主要原因之一。统计数据显示,国外一般住院患者和危重患急性肾损伤发生率分别高达5%和20%~30%;我国入院患者急性肾损伤发生率为11.6%,其中40%急性肾损伤患者与药物相关,这些都导致患者住院时间延长和治疗费用增加。目前,对于急性肾损伤的诊断和治疗方面仍然没有特异性方法。发病机制方面,主要认为是药物导致肾小管上皮细胞坏死后引起坏死性炎症反应,轻度损伤时肾小管上皮细胞可通过再生达到完全性修复,持续损伤或损伤较重时出现以肾脏纤维化为主的不完全修复,最终出现慢性肾脏疾病。大量研究都证实,在整个坏死性炎症反应、再生修复和纤维化过程中,MyD88分子作为TLRs/NF-κB通路最重要的转接蛋白,参与了细胞坏死和炎症反应;细胞再生、去分化和表型转化;以及纤维化形成,而且都起到不可或缺的作用。然而,所有关于MyD88蛋白或基因的研究都是采用蛋白拮抗或基因敲除的方法,但由于肾脏功能和结构的特殊性,肾脏细胞种类繁多,上述方法很难准确描述各类细胞在急性肾损伤发病机制中的作用。同时,考虑肾脏TECs是ATN和AKI发病机制中的最重要组织细胞之一,药物相关性AKI早期最主要的病理改变就是ATN。因此,本课题旨在进一步明确肾小管内MyD88基因对药物性AKI肾脏功能和形态学的影响,以及对损伤、修复相关标记物的影响及其相关可能机制。并为AKI研究提供新思路,为MyD88成为药物性AKI诊断和治疗中的新靶点提供理论依据。方法:根据Cre/Lox P基因敲除技术原理,将MyD88基因外显子3两侧加入Lox P酶切位点的转基因小鼠与含肾小管特异性Cre重组酶启动子的转基因小鼠杂交,通过基因型检测,保留特异性肾小管MyD88基因敲除(MyD88~(f/f) Ksp-Cre+)雄性小鼠。同时,明确肾小管上皮细胞内MyD88基因敲除情况。小鼠6~8周龄时用于腹腔内注射叶酸(250μg/g体重),建立稳定的急性肾损伤小鼠模型。将实验小鼠分为WT组和MyD88~(f/f) Ksp-Cre+组,分别留取叶酸注射前、注射后第2、7、14和28天的血、尿标本和肾脏标本,并检测肾功能和病理学改变,以及肾脏损伤、修复相关的生物标记物改变情况,同时,通过细胞衰老β-半乳糖苷酶染色和流式细胞仪检测FA注射后第2天细胞衰老情况。结果:1、MyD88~(f/f) Ksp-Cre+小鼠肾小管上皮细胞内MyD88基因m RNA相对表达量较巨噬细胞和WT小鼠内肾小管上皮细胞明显降低,分别为0.041±0.027、0.156±0.003和0.153±0.043,且均差异有统计学意义。同样,MyD88~(f/f) Ksp-Cre+小鼠肾小管上皮细胞内MyD88蛋白相对表达量较巨噬细胞和WT小鼠内肾小管上皮细胞明显降低,分别为0.145±0.0498、0.737±0.190和0.685±0.083,且均有统计学意义。WT组FA-AKI死亡率较MyD88~(f/f) Ksp-Cre+组升高,两者生存曲线经Log rank检验后,P=0.091,无明显统计学意义;2、WT组和MyD88~(f/f) Ksp-Cre+组血肌酐浓度在FA注射后第2天达高峰,分别为1.373±0.941 mg/d L和0.474±0.257 mg/d L,两者差异有统计学意义。尿微量白蛋白与尿肌酐浓度比值(ACR)也在FA注射后第2天达高峰,分别为137.699±97.542mg/g和180.800±132.665mg/g,两者差异无统计学意义;3、HE染色和PAS染色均显示,WT-d28组小鼠肾小管上皮细胞损伤及刷状缘缺失,以及炎症细胞浸润较MyD88~(f/f) Ksp-Cre+组严重程度更高。Masson’s Trichrome染色显示,WT组和MyD88~(f/f) Ksp-Cre+组纤维化面积百分比(%)分别为10.380±7.195和4.169±4.489,两者差异有统计学意义。检测肾脏胶原蛋白占总蛋白含量比值分别为0.062±0.031和0.041±0.012,差异有统计学意义;4、免疫荧光法检测WT-d28组和MyD88~(f/f)-d28组FA-AKI相关生物标记物,计数方法有标记物荧光面积占总面积百分比(%)或阳性细胞占总细胞数百分比(%),结果显示,肾小管损伤标记物:NGAL分别为1.227±1.192和0.461±0.419;KIM-1分别为1.096±0.837和0.251±0.302;DNA损伤标记物γ-H2AX分别为0.444±0.694和0.692±0.495;细胞增殖标记物:Ki67分别为1.937±1.513和2.464±1.349;纤维化形成相关标记物:FSP1分别为3.276±2.320和2.290±1.573;CD68分别为3.926±2.054和2.284±1.041;α-SMA分别为0.963±0.749和0.601±0.457;F4/80分别为1.020±0.902和0.568±0.644;CD31分别为0.649±0.447和1.478±1.220,以上标记物在两组间差异有统计学意义。而细胞凋亡检测TUNEL分别为0.015±0.012和0.014±0.017;Caspase3分别为0.003±0.004和0.004±0.003;肾小管转录抑制标记物H3K9me3分别为45.361±35.506和55.844±29.633,此部分标记物差异性无统计学意义;5、WT-d28组和MyD88~(f/f)-d28组,KIM-1、NGAL、IL-1α和IL-8基因相对表达量差异有统计学意义,而MMP-3、IL-1β和IL-6差异无统计学意义;6、WT-d2组和MyD88~(f/f)-d2组衰老细胞百分比(%)分别为7.853±2.382和3.02±0.559,两组差异有统计学意义。结论:1、可通过杂交MyD88~(f/f)小鼠与Ksp-Cre小鼠,获得MyD88~(f/f) Ksp-Cre小鼠,以达到特异性敲除肾小管上皮细胞内MyD88基因的目的;FA诱导AKI模型符合临床病理过程,死亡率在可接受范围,WT组和MyD88~(f/f) Ksp-Cre组小鼠生存曲线差异性符合实验要求。2、特异性敲除肾小管MyD88基因有效改善肾脏功能和保护肾脏组织结构完整性,并减轻组织损伤和降低纤维化程度,有利于AKI预后。3、特异性敲除肾小管MyD88基因可直接减轻肾小管损伤,促进细胞增殖,同时,通过减少炎症因子表达、肾实质细胞表型转化,以及减轻细胞衰老,以达到降低肾脏纤维化的作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R692

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本文编号：2432126