肺炎链球菌荚膜基因转录及其调控机制的研究

发布时间：2021-03-23 21:45

肺炎链球菌是寄生在人类上呼吸道上主要的病原菌之一。肺炎链球菌可以引起急性肺炎、脑膜炎、中耳炎和败血症等,每年在全球范围内至少导致1百多万人死亡。多糖荚膜是肺炎链球菌最重要的致病因子,主要通过其多糖分子的负电荷来排斥白细胞的吞噬,帮助细菌逃逸宿主免疫系统的检测和杀菌功能。肺炎链球菌能够产生至少97种不同的多糖荚膜(血清型),每种荚膜都是由单个(37型)或多个(其他型)基因(基因簇)所编码的多糖聚合酶来合成的。目前对肺炎链球菌荚膜合成基因在多糖合成和转运方面的功能已经有了大量的研究,但是在国际范围内对这些基因的转录调控机制仍然了解甚少。本课题的主要研究目标是阐述肺炎链球菌荚膜合成基因的转录机制。首先,我们研究分析了血清型2 D39菌株荚膜基因簇的转录特点。确定荚膜基因的转录起始位点位于cps2A基因(荚膜基因簇的第一个基因)上游第25th的鸟嘌呤G。通过染色体突变和荧光报告系统,揭示荚膜基因的转录不但依赖于cps2A基因上游核心启动子区域,而且还需要其上游的三个增强子元件(转座子插入序列IE、RUP和一个链接序列SS)。这些序列在D39菌株染色体上的敲除和置换实验显示核心启动子和每个增强子元件在荚膜合成和致病性方面都具有重要的贡献。其次,我们测定了225株肺炎链球菌临床菌株荚膜基因启动子和增强子DNA序列,结果发现这个区域在增强子元件的排布和DNA序列上具有高度的多样性。主要表现为:1)序列本身和长短的变化;2)核酸序列组合的多样化;3)保守序列的选择性组合;4)与荚膜基因非一一对应的关系。启动子增强子置换实验明确地揭示:荚膜基因增强子元件序列的变异会导致其下游荚膜基因转录水平的显著差异和荚膜厚度的相应变化。最后,增强子元件的变异可以导致肺炎链球菌菌株在致病性方面的显著性差异。综上所述,本课题在国际上第一次揭示了肺炎链球菌通过多个不同的增强子元件来调控荚膜基因的转录水平,从而调控其荚膜的厚度。肺炎链球菌还可以通过自然转化所介导的DNA序列平行转移来相互交换荚膜基因,改变荚膜基因增强子元件在染色体上的相对排布位置和DNA序列,由此调控荚膜厚度及其相关的生物学特性。本课题为充分理解肺炎链球菌荚膜合成的调控机理奠定了可靠的理论基础,为进一步阐明肺炎链球菌在致病性方面的分子机制提供了重要的信息。
【学位授予单位】：清华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378.12

文章目录

摘要

Abstract

主要英文缩略词对照表

第1章引言

1.1 肺炎链球菌概述

1.1.1 肺炎链球菌的侵染和定植

1.1.2 肺炎链球菌的抗药性

1.2 肺炎链球菌的逃逸机制

1.3 荚膜多糖是肺炎链球菌逃逸免疫系统的关键结构

1.4 肺炎链球菌表型多样性的决定因素

1.4.1 肺炎链球菌的自然转化能力

1.4.2 肺炎链球菌中非自然转化导致的特定位点的同源重组

1.5 肺炎链球菌中荚膜多糖所面临的科学问题和拟解决的问题

1.6 论文的研究方法

1.7 本论文的研究意义

1.8 本论文的研究结构

第2章实验材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验菌株和质粒

2.1.2 实验所需试剂

2.1.3 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 细菌培养

2.2.2 肺炎链球菌基因组DNA和大肠杆菌中质粒的提取

2.2.3 肺炎链球菌血清型的鉴定

2.2.4 肺炎链球菌自然转化实验

2.2.5 luc荧光蛋白报告系统的构建和测定

2.2.6 肺炎链球菌的基因敲除和回补菌株的构建

2.2.7 肺炎链球菌生长速率的测定

2.2.8 肺炎链球菌荚膜多糖的测定

2.2.9 肺炎链球菌与细胞的粘附实验

2.2.10 RNA提取和Northern印迹

2.2.11 逆转录PCR和实时定量PCR

2.2.12 引物延伸鉴定转录起始位点

2.2.13 肺炎链球菌的动物感染实验

2.2.14 七价疫苗抗体制备

2.2.15 统计分析

2.2.16 伦理申明

第3章针对肺炎链球菌荚膜多糖启动子和操纵子的研究

3.1 确定肺炎链球菌D39菌株中17个荚膜合成相关基因的共转录

3.2 鉴定肺炎链球菌D39的转录起始位点

3.3 确定肺炎链球菌D39荚膜基因上游序列对cps转录水平的影响

3.4 确定SS序列中影响荚膜基因转录水平的关键区域

3.5 确定肺炎链球菌D39荚膜基因上游dexB和cps2A之间的序列对荚膜合成的影响

3.6 确定肺炎链球菌TIGR4荚膜基因上游SS序列对cps转录水平和荚膜合成的影响

3.7 确定肺炎链球菌D39荚膜基因上游序列对粘附真核细胞的影响

3.8 确定D39荚膜基因上游序列对肺炎链球菌毒力的影响

3.9 肺炎链球菌荚膜多糖基因簇中保守基因cpsABCD对荚膜基因转录水平的影响

3.10 讨论

3.11 小结

第4章肺炎链球菌多样性荚膜启动子的生物学意义

4.1 侵袭性肺炎链球菌荚膜基因上游序列组成和核苷酸多态性分析

4.2 确定22种IPD荚膜基因上游序列对转录水平的影响

4.3 IPD荚膜基因上游序列的内在变化能调节荚膜的合成量

4.4 IPD荚膜基因上游序列的变化能调节与宿主细胞的粘附和致病性

4.5 肺炎链球菌血清型 6B多样性荚膜启动子在D39中的影响

4.6 血清型 6B多样性荚膜启动子在ST858（type 6B）中的影响

4.7 讨论

4.7.1 肺炎链球菌可以通过荚膜基因的转录变化调节荚膜的合成

4.7.2 肺炎链球菌多样性的荚膜启动子序列和致病性之间的关系

4.7.3 肺炎链球菌多样性的荚膜启动子序列是自然选择的结果

4.7.4 肺炎链球菌的自然转化能力是致使荚膜启动子多样性的主要机制

4.8 小结

第5章荚膜启动子core和SS序列中核苷酸功能的鉴定

5.1 荧光报告系统检测core序列中起关键作用的位点

5.2 荧光报告系统检测SS序列中起关键作用的位点

5.3 讨论

5.4 小结

第6章总结和展望

6.1 论文总结

6.2 论文展望

6.2.1 氧气浓度影响肺炎链球菌荚膜合成的思考

6.2.2 糖水化合物影响肺炎链球菌荚膜合成的思考

6.2.3 上皮细胞影响肺炎链球菌荚膜合成的思考

6.2.4 血液成分影响肺炎链球菌荚膜合成的思考

6.2.5 生物被膜形成对肺炎链球菌荚膜合成影响的思考

6.2.6 肺炎链球菌荚膜基因cpsABCD对荚膜合成的影响

6.2.7 SpxB和SpxR对肺炎链球菌荚膜合成的影响

6.2.8 限制修饰系统对肺炎链球菌荚膜合成的影响

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究

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