罗非鱼耐盐碱相关基因AQP1、mTOR克隆和表达特征分析

发布时间：2019-03-17 13:23

【摘要】：罗非鱼是暖水性鱼类,隶属于鲈形目(Perciformes)、丽鱼科(Cichlidae)。罗非鱼生长快、养成周期短、易繁殖,是当前淡水养殖的重要养殖品种之一。盐碱是水体中影响鱼类渗透压平衡的重要因素之一,盐碱水通过高p H、高盐度、高碱度对鱼类造成器质性损伤,进而影响鱼类的渗透压平衡。水通道蛋白1(AQP1)和雷帕霉素靶蛋白(m TOR)是与鱼类渗透压调节相关的耐盐碱基因,本研究将以橙色莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)、荷那龙罗非鱼(O.hornorum)及其正交子代莫荷罗非鱼(O.mossambicus♀×O.hornorum♂,橙色莫桑比克罗非鱼♀×荷那龙罗非鱼♂)为实验材料,对其急性耐碱胁迫性能进行评估,克隆AQP1和m TOR基因并进行生物信息学分析,研究罗非鱼的鳃、肾、肠等组织中该基因在盐碱胁迫下的表达特征,从分子水平探索分析罗非鱼的耐盐碱差异,以期为日后研究罗非鱼的耐盐碱机制和开展鱼类抗逆育种提供参考。1橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼及莫荷罗非鱼急性耐碱胁迫能力的初步研究为评估三种罗非鱼的碱度(Na HCO3质量浓度)急性耐受性能,分别测定了橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼及其正交子代莫荷罗非鱼的96h半致死碱度浓度。急性耐碱胁迫实验表明,在p H为9.3-9.5条件下,橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼及莫荷罗非鱼的96h半致死碱度分别为3.99 g/L、6.67 g/L、4.96g/L。结果表明,荷那龙罗非鱼的急性耐碱胁迫性能最强,其正交子代莫荷罗非鱼的急性耐碱胁迫能力介于两亲本之间,莫桑比克罗非鱼的急性耐碱胁迫性能相对较差。2橙色莫桑比克罗非鱼AQP1基因和荷那龙罗非鱼m TOR基因的克隆与序列分析分别以橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼总RNA为模板,通过目的片段、5’和3’端序列的扩增、拼接得到AQP1和m TOR c DNA全长序列。其中莫桑比克罗非鱼AQP1 c DNA全长2612 bp,包含1760 bp的5’端非编码区、774 bp开放阅读框(ORF)和75 bp的3’端非编码区,共编码257个氨基酸,其DNA序列全长3215 bp,包含2个内含子,3个外显子;TMHMM 2.0在线软件分析表明橙色莫桑比克罗非鱼AQP1含有6个跨膜区,2个NPA结构单元和一个潜在的抑制细胞透水性的半胱氨酸残基结合位点TGCG。荷那龙m TOR c DNA序列全长8193bp,包含158bp的5’端非编码区、7551bp开放阅读框(ORF)和484 bp的3’端非编码区,共编码2515个氨基酸,含有300个(Asp+Glu)负电氨基酸残基和281个(Arg+Lys)正电氨基酸残基理论,等电点(Isoelecric point)为6.53。经过BLAST氨基酸序列比对,橙色莫桑比克罗非鱼AQP1和荷那龙罗非鱼m TOR基因分别与尼罗罗非鱼的同源性达99%;用MEGA 5.1构建NJ系统进化树显示,橙色莫桑比克罗非鱼AQP1和荷那龙罗非鱼m TOR基因都最先与尼罗罗非鱼聚为一支,再与鲈形目鱼类聚为一支。通过保守结构域的分析,AQP具有高保守特征序列NPA序列和两性分子通道;m TOR具有ATP结合位点(ATP binding site)、催化环(catalytic loop)、活化环(activation loop)和多肽结合位点(polypeptide binding site)等保守结构域。3盐碱胁迫下罗非鱼鳃、肾、肠组织中AQP1和m TOR基因的表达特征3.1基因AQP1在盐碱胁迫下的表达特征橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼及其正交子代莫荷罗非鱼和尼罗罗非鱼鳃组织中AQP1的表达量在淡水中比盐碱胁迫下的表达量要高且存在显著性差异(p0.05);且四种罗非鱼肾中AQP1基因的表达量随着盐碱胁迫时间的延长有下降趋势且差异显著(p0.05);由此可见AQP1基因的表达变化与环境中的盐碱胁迫有关。3.2基因m TOR在盐碱胁迫下的表达特征橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼、莫荷罗非鱼和尼罗罗非鱼鳃组织中m TOR的表达量在0h表达量较高,随着盐碱胁迫时间的延长m TOR的表达量呈下降趋势并趋于稳定;四种罗非鱼肾中m TOR表达量变化呈现先下降后上升又下降的趋势且差异显著(p0.05);四种罗非鱼肠中m TOR的表达量整体呈下降趋势,且0h m TOR表达量与其他时间点存在显著差异(p0.05);可以看出m TOR基因与四种罗非鱼的盐碱耐受性有关,参与渗透压调节。
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【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4

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