仿病毒膜融合的电荷反转高分子基因输送体系的研究

发布时间：2019-03-29 21:19

【摘要】：基因治疗是指将外源基因物质输送到靶细胞、以纠正或补偿基因的缺陷,从而达到治疗目的,已被证明是一种有效的具有低副作用的癌症治疗新手段。非病毒载体包括阳离子脂质体、聚合物、树枝状大分子和多肽等,因其具有良好的安全性和生物相容性、低的免疫原性、易于化学修饰和大规模生产等特点而引起了广泛关注。但与病毒载体相比,较低的基因转染效率一直是困扰其应用的瓶颈。其中,阳离子聚合物可通过中和DNA的负电荷而将其压缩成纳米颗粒,从而保护DNA不被降解,同时促进细胞摄取,将DNA输送到细胞中进行转染。但是,通过正/负静电相互作用形成的阳离子聚合物/核酸药物复合物纳米颗粒热力学上非常稳定,难以解离释放出DNA进行转染；同时,阳离子聚合物在细胞内有可能与参与转录和翻译的物质如mRNA、酶等相互作用,干扰转染过程,导致核酸药物难以发挥药效。因此,设计能够响应细胞内微环境从而能够快速释放出DNA等核酸药物的载体,是提高核酸药物药效的关键。本论文第一部分设计了一种基于氧化响应的电荷反转型聚合物的膜融合型基因输送体系,成功地解决了这些难题。肿瘤细胞内异常的生理特点使其含有大量的活性氧自由基(ROS),包括过氧化氢(H202)、超氧阴离子(O2-)、氢氧根自由基(OH·),这些活性氧自由基能够将苯硼酸或酯氧化为酚基。该聚合物是含有p-硼酸苄基季铵盐的阳离子键合物(B-PDEAEA),能与带负电的DNA等核酸药物通过静电自组装形成稳定的纳米复合物。进入细胞后,硼酸被ROS氧化时发生去酚基苄醇反应,季铵盐转变为三级胺,随后通过胺基的自催化酯键水解生成带负电的聚丙烯酸,从而与带负电的核酸药物相互排斥而与之快速解离,释放出核酸药物进行有效转染。进一步地,通过在阳离子纳米复合物表面包裹一层脂质体膜并调节其组成,使该脂质层能够以类似于病毒入胞的膜融合方式,将纳米复合物直接“吐”入细胞质中,避开了溶酶体陷阱因而避免了DNA被溶酶体中的酶降解。该载体系统在体内能够稳定存在,循环时间长,并能够在肿瘤部位有效蓄积,可以成功将治疗基因TRAIL输送到肿瘤部位,实现比阿霉素更好的抑瘤效果,且毒副作用很低。本论文第二部分基于上述氧化响应的电荷反转型聚合物设计了两种具有抗血清特性的阳离子脂质体基因输送体系,它们能够提高原有阳离子聚合物抗血清能力,防止聚合物和DNA形成的纳米复合物在高血清条件下过早解离,表面大量的正电荷还能促进细胞摄取,增强肿瘤渗透能力,同时阳离子脂质体能够刺激细胞内ROS的产生,有利于输送体系从溶酶体逃逸后,纳米复合物在细胞质中ROS刺激作用下发生电荷反转,解离并释放DNA。该体系在50%甚至100%的高血清条件下在细胞水平上依然能够维持非常高效的转染效率——通过胞膜窖介导的内吞作用快速被细胞摄取,从溶酶体逃逸,解离,释放DNA进入细胞核。在A549腹腔移植瘤模型中成功将治疗基因TRAIL输送到肿瘤部位,表现出明显高于B-PDEAEA/TRAIL,Lipo 2000/TRAIL和PEI/TRAIL的抑瘤效率,与化疗药物紫杉醇(PTX)相媲美,同时没有毒副作用。在4T1-Luc-GFP转移瘤模型中表现出比PEI/TRAIL更好的抗转移能力,小鼠肺部转移灶大大减少。本论文第三部分基于以上氧化响应的电荷反转型聚合物B-PDEAEA的设计思路和应用,设计合成了一系列基于苯硼酸氧化特性的的去电荷阳离子聚合物,其中包括p-硼酸基卞溴季铵化的聚甲基丙烯酸N,N-二乙基氨基乙酯(B-PDEAEMA),以及溴代(2-丙烯酰氧)乙基(p-硼酸苄基)二乙铵与PEI或PAMAM通过迈克尔加成反应制备得到的季铵化水溶性聚合物B-PEI和B-PAMAM。这些阳离子聚合物在细胞水平上均获得高效的转染效率,基于B-PDEAEMA设计的膜融合型基因输送体系在SW480结肠癌移植瘤模型中成功将治疗基因TRAIL输送到肿瘤部位,实现比化疗药物5-氟尿嘧啶更好的抑瘤效果。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R450
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本文编号：2449893