肇东盐单胞菌中耐盐碱基因筛选及DUF1538与DUF2062家族成员的耐盐碱功能鉴定

发布时间：2019-04-04 19:34

【摘要】：嗜盐菌由于其独特的耐盐碱代谢机制和遗传特性已受到许多微生物学、生态学和土壤学研究工作者的广泛关注,是一类极具基础研究价值和发掘新的耐盐碱机制的重要微生物资源,而对这类微生物新的耐盐机制的研究还可以为改造农作物、开发微生物肥料、促进粮食增产等提供重要的理论依据。肇东盐单胞菌(Halomonas zhaodongensis)是一株分离自黑龙江省肇东盐碱地的革兰氏阴性轻度嗜盐菌,它能在0-15%的S-G培养基上生长(最适盐浓度为3%)。本研究借助大肠杆菌(Escherichia coli)盐敏感突变株KNabc(Δnha A,Δnha B,Δcha A),利用基因文库筛选和功能互补相结合的技术方法,以发掘更多未知的耐盐碱基因,并对它们所编码的蛋白功能进行研究。本研究利用含有0.2 M Na Cl的氨苄抗性固体培养基作为筛选工具,用以克隆肇东盐单胞菌中潜在的与耐盐碱有关的基因。实验共获得21个能使KNabc突变株在0.2 M Na Cl的培养基上恢复生长能力的重组质粒,经过酶切及测序分析,发现这21个重组质粒中,包括一对属于DUF1538(domain of unknown function with No.1538 family)家族的蛋白和一个属于DUF2062家族(domain of unknown function with No.2062 family)的蛋白,它们的功能尚未被注释,实验结果表明它们均是与耐盐有关的基因,本文将它们分别被命名为ump AB(unknown membrane protein)、duf2062。ump AB基因序列全长1580 bp,由两个开放阅读框(ORF)组成,其中第一个阅读框(ump A,765 bp)终止密码子的最后一个碱基与第二个阅读框(ump B,816 bp)起始密码子的“A”碱基重叠在一起。它们编码的蛋白序列分别由254个和271个氨基酸残基组成,并将其分别命名为Hz_Ump A、Hz_Ump B(from Halomonas zhaodongensis)。跨膜预测分析也显示,它们皆具有7个跨膜区,它们和亲缘关系最近的12个同系物有47个高度保守的氨基酸残基,其中包括36个疏水性氨基酸、6个带正电的氨基酸、5个极性氨基酸。同源比对显示,Hz_Ump A和Hz_Ump B同属于一个未知功能的DUF1538(domain of unknown function with No.1538family)蛋白家族,该家族在NCBI的Pfam数据库中被定义为一类功能未知的、具有同一个保守结构域的蛋白集合,其发现顺序为1538。更重要的是,Hz_Ump A和Hz_Ump B与已知的钠/氢逆向转运蛋白或具有钠/氢逆向转运活性的其他蛋白没有任何同源性。系统发育分析显示,它们与各自同源性在50%以上的同系物聚簇成阙值(bootstrap values)为96%和99%的两个分支,但是与已知的钠/氢逆向转运蛋白或具有钠/氢逆向转运活性的其他蛋白的进化距离较远。除此之外,功能互补的实验揭示了ump AB基因具有一定的耐盐碱能力,在0.4 M Na Cl或30 mM Li Cl的盐胁迫下,ump AB能使盐敏感突变株KNabc恢复生长,而单独的ump A,ump B却不能;当Na Cl浓度为0-0.15 M时,与负对照相比,单独的Hz_Ump B具有一定的耐盐能力,而单独的Hz_Ump A在有盐条件下生长受到抑制;单独的Hz_Ump A和Hz_Ump B具有一定程度的耐碱能力,且后者要好于前者。考虑到Hz_Ump B比Hz_Ump A多出一个亲水的C末端,我们推测多出的这一亲水C末端在其耐盐碱过程中起到比较关键的作用。功能分析表明,Hz_Ump AB具有Na~+(Li~+,K~+)/H~+逆向转运蛋白活性,且这个活性具有一定的p H依赖性,其最适活性p H为9.0,对Na~+、Li~+、K~+三种离子的K0.5值分别是0.26±0.06 m M、0.46±0.09 m M、0.41±0.06 m M,换而言之,Hz_Ump AB对底物的偏好性是:Na~+K~+Li~+。为了进一步研究Hz_Ump AB的细胞定位及二聚体鉴定,我们构建了共表达载体p ETDuet-1-ump AB,运用超离蛋白分级法对菌体的膜蛋白及胞浆蛋白进行分离,Western Blot检测显示,Hz_Ump A和Hz_Ump B的蛋白条带(约25 KDa)仅在全蛋白样品和膜蛋白样品中被检测出来,而且它们的确是大小不同的两个蛋白,这就表明,Hz_Ump AB均定位于细胞质膜。Co-IP显示,在免疫沉淀Hz_Ump A蛋白时,用Western Blot分析也能检测到Hz_Ump B的蛋白条带,表明Hz_Ump AB很可能是由两个膜蛋白构成的一个异源二聚体。duf2062基因序列全长552 bp,可编码的蛋白由183个氨基酸残基组成,将其命名为Hz_DUF2062。功能互补实验显示,它可使盐敏感突变株KNabc在0.3 M Na Cl或5 m M LiCl的培养基上恢复生长,而且在偏碱性的环境中,其生长能力要明显好于负对照。这表明了该基因具有一定的耐盐碱能力,且可能具有钠/氢逆向转运蛋白活性。跨膜预测分析显示,Hz_DUF2062具有3个跨膜区,和它们亲缘关系最近的同系物有54个高度保守的氨基酸残基,其中主要包括28个疏水性氨基酸、10个带正电的氨基酸和13个极性氨基酸;同源比对表明,Hz_DUF2062属于一个未知功能的DUF2062蛋白家族,而与已知的钠/氢逆向转运蛋白或具有钠/氢逆向转运活性的蛋白没有任何同源性。系统进化发育学分析表明,Hz_DUF2062与同家族的其他蛋白聚集在一簇,阙值(bootstrap values)为91%,且此分支与已知的钠/氢逆向转运蛋白或具有钠/氢逆向转运活性的蛋白的进化距离较远。功能分析表明,Hz_DUF2062具有Na~+(Li~+、K~+)/H~+逆向转运蛋白活性,以上活性具有pH依赖性,其最适活性p H为8.5,对Na~+、Li~+、K~+三种离子的K0.5值分别是0.2±0.13 mM、0.22±0.1 m M、0.43±0.08 m M,换而言之,Hz_DUF2062对底物的偏好性是:Na~+Li~+K~+。综上所述,本研究首先对Hz_Ump AB和Hz_DUF2062两个蛋白的功能进行了注释,首次报道了未知功能的DUF1538家族和DUF2062家族成员的确切功能,即代表DUF1538家族的蛋白对Hz_Ump AB和代表DUF2062家族的蛋白Hz_DUF2062具有Na~+(Li~+,K~+)/H~+逆向转运蛋白活性,同时还重点研究了Hz_Ump AB的细胞定位及这个异源二聚体的鉴定。基于以上结果,我们建议来自肇东盐单胞菌(H.zhaodongensis)中的Hz_Ump AB蛋白对和Hz_DUF2062蛋白是两个新型的Na~+(Li~+、K~+)/H~+逆向转运蛋白。而且,我们也通过Co-IP首次揭示了钠/氢逆向转运蛋白的新结构,即钠/氢逆向转运蛋白的结构除了同源二聚体和异源多聚体之外,还应有像Hz_Ump AB这样的异源二聚体结构。
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【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q933;S156.4

【参考文献】