白甲乌鳢种质分析、白化特征机理及其热休克蛋白基因的研究

发布时间：2019-04-22 15:13

【摘要】：本研究以珍稀的白甲乌鳢作为研究材料,利用形态学、生物学、组织学、分子生物学等方法对白甲乌鳢和乌鳢进行了比较研究,综合探讨了其分类归属、皮肤白化特征机理及其引种养殖过程中的抗应激能力等问题。1,基于形态学方法的部分鳢属鱼类系统发育关系本章运用传统形态度量法与框架法对5种鳢89个个体的11个可数和29个可量性状进行了测量。主成分分析显示所有5个主成分的累积贡献率达到78.928%。主成分分析散点图显示白甲乌鳢和乌鳢重叠最大。聚类分析显示各种间可完全区分,其中白甲乌鳢和乌鳢亲缘关系最近。通过X射线摄影发现白甲乌鳢和乌鳢形态结果较为相似。由此可知,白甲乌鳢和乌鳢较为相近,无明显区别,杂交鳢也偏向于父本乌鳢。2,基于毛细管电泳的AFLP标记技术探讨部分鳢属鱼类亲缘关系本章采用AFLP-毛细管电泳技术研究了8种鳢属鱼类的系统发育关系。共筛选出10对选择性扩增引物组合,扩增总条带范围为114-206,一致性条带为0-12,多态性条带为114-196。聚类结果显示,依相似系数0.58的水平,乌鳢、白甲乌鳢、杂交鳢和斑鳢聚为一支,且乌鳢和白甲乌鳢的亲缘关系最近,月鳢和带鳢聚为一支,而线鳢和小盾鳢分别单独聚为一支。该技术能有效区分鳢属鱼类的亲缘关系,为种质资源的开发利用提供一定的分子佐证材料。3.基于白甲乌鳢线粒体DNA全序列及其12s RNA、Cytb和CO1基因与D-Loop控制区序列的鳢科鱼类系统发育关系本章首先测定了白甲乌鳢线粒体DNA全基因组序列,全长16558bp,与乌鳢一致。利用MEGA6.0软件构建鳢科鱼类的遗传距离,其中白甲乌鳢和乌鳢之间的遗传距离为0.002。采用NJ、ME和ML法分别构建分子系统树,其中白甲乌鳢、乌鳢和乌斑杂交鳢单独聚为一支。同时比较分析了其12s rRNA、Cytb和CO1基因及其D-Loop控制区序列,白甲乌鳢和乌鳢单倍型序列之间的最大遗传距离均小于0.010,分别为0.006、0.002、0.002和0.004;分子系统树显示它们所有单倍型均单独聚为一支,且交叉排列,进一步得出白甲乌鳢应作为乌鳢白化变异种的结论。4,白甲乌鳢与乌鳢基本营养成分、皮肤黑色素含量及其组织学分析选取同一养殖水域的白甲乌鳢和乌鳢。分析肌肉基本营养成分发现白甲乌鳢较乌鳢有更高的食用营养价值,同时测定其皮肤黑色素含量显著低于乌鳢。光学显微镜观察白甲乌鳢与乌鳢鳞片和皮肤黑色素细胞在分布、密度、形态、大小和生长状态等方面存在明显差异。he和黑色素染色技术比较观察皮肤显微结构发现白甲乌鳢皮肤色素层趋于退化,且无明显黑色素细胞分布。利用透射电子显微镜对比分析皮肤超微结构发现白甲乌鳢皮肤黑色素细胞的黑色素体密度较小,排列混乱,呈现多种形状,真皮层的各层细胞排列不规则,无层次性。可见,黑色素细胞和黑色素沉积的缺乏、黑色素体密度较小等是导致白甲乌鳢皮肤白化现象的组织学原因。5,白甲乌鳢酪氨酸酶(tyr)基因的克隆,表达及其分子特征克隆了白甲乌鳢和乌鳢tyr基因cdna全长,两者序列一致。同源比对发现,与硬骨鱼类相似性较高,而与细菌类相似度较低。相对实时荧光定量pcr结果显示tyr基因在白甲乌鳢和乌鳢9大组织(皮肤、眼睛、肌肉、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、鳃和肠道)中均有表达。其中,白甲乌鳢眼睛组织表达量最高,而乌鳢皮肤组织的表达量最高。对比相同组织发现,乌鳢皮肤组织tyr基因表达量极显著高于白甲乌鳢(18.66倍)。细胞免疫荧光观察亚细胞定位于内质网、高尔基体、细胞质膜等部位,与预测结果一致。可见,tyr基因可能作为参与乌鳢皮肤黑色素细胞发育、分化和功能调节的重要因子,其低表达是皮肤出现白化特征的关键因素之一。6,白甲乌鳢小眼畸形相关转录因子(mitf)基因的克隆,表达及其分子特征分析克隆了白甲乌鳢和乌鳢mitf基因cdna全长,两者序列一致。同源比对发现,与硬骨鱼类相似性较高,而与昆虫类相似性较低。相对实时荧光定量pcr结果显示mitf基因在白甲乌鳢心脏组织表达量最高,而在乌鳢肌肉组织表达量最高。对比相同组织发现,乌鳢皮肤mitf基因表达量极显著高于白甲乌鳢(8.77倍)。细胞免疫荧光观察亚细胞主要定位于细胞核,与预测结果一致。可见,mitf基因可能作为参与白甲乌鳢皮肤体色调控,其低表达可能与皮肤出现白化特征密切相关。7,白甲乌鳢sox10基因的克隆,表达及其分子特征分析克隆了白甲乌鳢和乌鳢sox10基因cdna全长,两者序列一致。同源比对发现,与硬骨鱼类的相似性较高,而与其它脊椎动物相似性较低。相对实时荧光定量pcr结果显示sox10基因在白甲乌鳢眼睛组织的表达量最高,而在乌鳢皮肤组织中表达量最高。对比相同组织发现,乌鳢皮肤sox10基因表达量极显著高于白甲乌鳢(14.44倍)。细胞免疫荧光观察亚细胞主要定位于细胞核,与预测结果一致。可见,sox10基因可能参与白甲乌鳢体色调节,其低表达是皮肤出现白化特征的重要因素之一。8,白甲乌鳢hsp60基因的克隆,表达及其分子特征分析克隆了白甲乌鳢hsp60基因cdna和基因组dna全长,符合hsp60基因家族的特征。同源比对发现,与硬骨鱼类相似性极高,而与细菌类的相似性较低。相对实时荧光定量PCR发现正常对照组(0h)HSP60基因的表达存在显著组织特异性。相比于常温处理组(26℃),经热处理(37℃)后的白甲乌鳢脑、肾脏、肝脏和脾脏组织HSP60基因的表达量均极显著的升高,而低温处理组(8.5℃)除脑组织表现出极显著性降低外,其他组织均无显著差异。注射迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)(菌株NO.DL1476)不同时间(0-,6-,12-,24-,36-,48-,72h)后的HSP60基因在白甲乌鳢大脑、脾脏和肾脏组织中不同时间均出现极显著的升高;在肝脏中一直处于高表达状态。可见,HSP60基因在应对外界不良环境因子、维持机体稳态、保证正常生命活动起到重要调节作用。9,白甲乌鳢HSP70基因的克隆,表达及其分子特征分析克隆了白甲乌鳢HSP70基因cDNA和基因组DNA全长,符合HSP70基因家族的特征。同源比对发现,与所用物种相似性均很高。相对实时荧光定量PCR发现正常对照组四大组织的表达存在高度特异性。相比于常温处理组,热处理后的四大组织HSP70基因均表现出极显著的升高,而低温处理组均无显著差异。经过注射迟缓爱德华氏菌不同时间后的四大组织均出现极显著的升高。结果说明HSP70基因在调节机体免疫反应及保护其致病的过程中发挥极其重要的作用。10,白甲乌鳢HSP90基因的克隆,表达及其分子特征分析克隆了白甲乌鳢HSP90基因cDNA和基因组DNA全长,符合HSP90基因家族的特征。同源比对发现,与硬骨鱼纲的鱼类相似性很高,而与细菌类相似性较低。相对实时荧光定量PCR发现正常对照组四大组织存在特异性表达。相比于常温处理组,热处理后的四大组织HSP90基因均表现极显著升高,而低温处理组均无显著性差异。经过迟缓爱德华氏菌注射不同时间后的四大组织均出现了极显著的升高,在肝脏组织中一直呈现高表达。可见,HSP90基因能够有效的应对热应激和病原菌感染,对正常生命活动起到重要的调节作用。
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【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S965.199

【参考文献】