拟南芥HECT类泛素蛋白连接酶家族基因表达和功能的初步研究

发布时间：2019-04-26 20:48

【摘要】：HECT类泛素蛋白连接酶(HECT E3s)作为一种主要的泛素连接酶类型存在于几乎所有真核生物的细胞中,这类酶在其羧基端包含有一个由约350个氨基酸组成的HECT结构域。HECT E3s通过选择性地识别细胞内的活性蛋白并通过26S蛋白酶体介导的降解途径来调控许多重要的生物过程。HECT E3s的功能目前在动物中已经做了比较深入的研究,发现其在与疾病相关的各种过程中发挥着重要的作用。在植物中这一家族中的某些成员在调控植物的生长和发育的过程如衰老、毛状体的发育、非生物胁迫等过程中也发挥着重要的作用,但是其中所涉及的具体机制仍不清楚。在拟南芥中含有7个HECT E3s,仅UPL3和UPL5基因的表达和功能有初步的研究。为此,本研究通过克隆拟南芥中HECT家族其中6个成员UPL1、UPL2、UPL3、 UPL4、UPL口UPL7的启动子并连接到GUS报告基因的上游,构建ProUPLs-GUS启动子活性分析载体,通过农杆菌浸染野生型拟南芥获得转基因植株；通过GUS组织化学染色对不同发育时期和不同组织器官的材料进行染色,从而系统地认识这6个HECT类泛素蛋白连接酶家族基因的表达模式。同时,通过对UPL基因家族的T-DNA插入突变体进行筛选和鉴定,对这些UPL基因单突变情况下的植株表型和功能进行了初步分析。具体获得的实验结果如下：(1)在转基因拟南芥种子萌发的早期,除了UPL6基因启动子驱动的GUS报告基因仅在萌发后2天(2 DAG)的小苗子叶中检测到表达外,其它UPLs基因的启动子驱动的GUS基因在2 DAG和5 DAG时在下胚轴、子叶和根尖成熟区的中柱鞘中均有表达；UPL2和UPL4基因的启动子还在根尖分生区和根毛中有活性；UPL4的启动子在根尖伸长区的中柱鞘中有活性；7DAG之后整个UPL家族基因的启动子在新生部位真叶和毛状体中均有活性；(2)系统地对ProuPLs-GUS启动子转基因拟南芥植株在营养和生殖阶段的莲座叶进行染色,发现UPL1和UPL4启动子在老叶中活性高于年轻叶；而UPL2和UPL3启动子在中间龄叶片的活性高于老叶和嫩叶；UPL6基因的启动子则在老叶和嫩叶中活性相当,且高于中间龄叶片活性；UPL7基因的启动子在不同叶龄莲座叶中活性无明显差异。(3)对转基因植株花序进行GUS组织化学染色,发现这六个基因的启动子在茎、花梗、花托和花萼等组织中均有活性。除UPL1基因在花丝和柱头上没有启动子活性外,其他基因的启动子都有活性；且UPL2基因的启动子在花药中的活性较高。(3)对转基因植株的角果进行染色,发现这六个UPL家族成员的启动子在角果柄中都有活性；UPL2、UPL3、UPL4、UPL6和UPL7的启动子还在角果的果皮上有活性；在角果发育的早期UPL3、UPL4和UPL6基因的启动子还在角果的顶端有活性；UPL2的启动子在种子中有特异活性；(4)利用三引物法鉴定拟南芥UPL基因家族成员的T-DNA插入突变体并获得纯合体植株,通过qRT-PCR鉴定所筛选纯合体的转录水平,并对获得的UPL2、UPL3、UPL4和UPL6基因的纯合突变体植株进行包括叶绿素含量、黄绿叶统计、光合效率等衰老表型的观察和下游相关基因的表达分析,结果表明：从植株生长的25 DAG到67 DAG的观察期内,各突变体在60 DAG时都表现出轻微的衰老延缓表型,在53 DAG的各突变体的莲座叶中检测下游衰老相关基因的表达,发现衰老负调控相关的NEET基因都有不同程度的上调表达,进一步证实UPL2、UPL3、UPL4和UPL6基因可能跟衰老调控有一定的关系。
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【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2

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