芹菜金属硫蛋白基因的克隆和功能研究

发布时间：2019-05-11 10:19

【摘要】：适宜的环境可以促进蔬菜作物的正常生长和发育,逆境胁迫会大幅度制约作物的产量和品质。此外,随着中国工业化、城市化进程的不断加快,一系列废气、废水、废物被排放到空气、水体、土壤中,累积了大量的重金属。动植物作为人类的主要食物来源,易被重金属污染,且重金属会在其体内不断积累,人类食用后会对自身健康造成严重危害。芹菜(ApiumgraveolensL.)属于伞形科、芹属的植物,是一种世界范围广泛种植的伞形科蔬菜作物,也是我国广泛种植的重要叶菜类蔬菜之一。在逆境胁迫、重金属污染下,芹菜植株的生长和发育会受到制约和影响。本试验以芹菜为研究对象,分别从'六合黄心芹'、美国西芹'文图拉'2个芹菜品种中获得了Agmt2基因,该基因编码的这类蛋白被认为可以提高植物的抗逆境能力(尤其是抗重金属胁迫能力)。对Agmt2基因序列进行分析,并分析芹菜在不同逆境处理的表达图谱,初步验证该基因功能。通过大肠杆菌表达,分离纯化出AgMT2蛋白,将Agmt2基因转入到拟南芥中,获得转基因植株,以进一步研究芹菜对重金属胁迫的响应机制。本论文的主要研究结果如下:1、基于本课题组芹菜转录组数据,分别以南京地方品种'六合黄心芹'、美国西芹'文图拉,为材料,克隆得到2个Agmt2基因。分析表明,芹菜Agmt2基因含有两段内含子,开放阅读框序列全长为231 bp,编码具有76个氨基酸残基的AgMT2蛋白。'六合黄心芹'与'文图拉'的Agmt2基因开放阅读框序列核苷酸相似度为99.56%,氨基酸序列100%一致。多重序列和理化性质分析表明,AgMT2的分子量和等电点分别是7.5 kDa和4.95。多重序列分析发现,金属硫蛋白2的结构域在高等植物的进化中是高度保守的。进化树分析结果显示,AgMT2与同是伞形科的水芹和短果茴芹金属硫蛋白2的进化关系最近。荧光定量表达分析表明,Agmt2基因在芹菜中的表达具有组织特异性。在8种金属(Co~(2+)、Ni~(2+)、Fe~(2+)、Mg~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+))和逆境胁迫(高低温、干旱和盐处理)处理下,Agmt2基因在'文图拉,中的表达比'六合黄心芹'中的表达表现出更显著的上升响应。2、以从芹菜'文图拉'中克隆得到的Agmt2基因为基础,构建pET-30a(+)-AgMT2表达载体。构建成功之后,通过大肠杆菌表达,获得浓度为0.42 mg/mL的AgMT2纯化蛋白。SDS-PAGE判断蛋白大小约为20.1 kDa。此外,将含有AgMT2表达的大肠杆菌细胞和对照细胞同时涂布在含有重金属离子的培养基上进行处理,鉴定AgMT2的金属耐受性。结果表明,在受到Cd~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)胁迫后,表达AgMT2的大肠杆菌细胞比对照细胞的耐受性更强,且携带Cd~(2+)、Zn~(2+)的能力比Cu~(2+)强。这表明,AgMT2是一种可以有效表达在大肠杆菌中,且具有特异性结合重金属离子能力的功能蛋白。3、本试验使用蘸花法,将芹菜'文图拉'中的Agmt2基因转入到拟南芥中,结合不同的方法,如培养基筛选、GUS染色、PCR验证、表型观察等多种方法鉴定获得转基因拟南芥植株。经过种植和筛选,获得转基因T3代转基因拟南芥植株。此外,为了进一步验证AgMT2的重金属解毒和自由基清除功能,将转基因拟南芥植株和对照植株进行15天重金属处理,分别浇灌100μM的Cd~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)和蒸馏水,测定生理指标:谷胱甘肽(GSH)含量、叶绿素含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和过氧化物酶(POD)活性。结果表明:在重金属胁迫下,转基因拟南芥植株的GSH含量、总叶绿素含量、SOD活性和POD活性变化量均明显高于对照植株。这说明,受到重金属胁迫后,转Agmt2基因拟南芥植株比对照植株表现出更强的重金属解毒和自由基清除能力。本研究为伞形科重要蔬菜芹菜的逆境响应的研究提供了资源,为进一步深入开展芹菜新品种选育奠定了基础。
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【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S636.3

【参考文献】