蛋白酶Tmprss11f基因敲除小鼠的制备及表型分析

发布时间：2019-06-18 20:01

【摘要】：研究目的：Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶(Type Ⅱ Transmembrane Serine Proteases, TTSPs)是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶超家族中的一个亚家族。在结构上,所有的TTSPs都包含个近氨基端的跨膜区以及一个羧基端的蛋白酶区。TTSPs通过跨膜区锚定在细胞膜上,而蛋白酶区是TTSPs在细胞膜表面催化蛋白水解的功能活性区域。TTSP家族的成员包括肠激酶、corin、matriptases 以及 hepsin等,它们参与了许多生理病理过程,比如食物消化、血压调节、铁代谢、耳蜗发育等。TTSP s的表达缺失或缺陷会引起营养不良、高血压、缺铁性贫血以及先天性耳聋等疾病。人类的TTSPs有19个成员,分为4个亚组,包括hepsin/TMPRSS组、matriptase组、HAT/DESC组以及corin组。蛋白酶TMPRSS11f (又名HAT-Like 4, HATL4)是HAT/DESC亚组中的一个成员。我们实验室最新研究发现,TMPRSS11f在正常人的血细胞以及骨髓细胞中不表达,而在急性髓细胞性白血病(Acute Myeloid Leukemia, AML)细胞中异常高表达；并且TMPRSS11f的异常表达与AML病人的不良临床预后有关。这提示TMPRSS11f可能参与了AML的病理过程。然而,迄今还没有研究报道TMPRSS11f的正常生物学功能。本研究旨在检测TMPRSS11f在人及小鼠组织中的表达情况,然后利用CRISPR/Cas9技术构建了Tmprss1 1f基因敲除小鼠,并对其表型进行分析。通过对Tmprss11f基因敲除小鼠的生存能力、生育能力、发育状况和血液指标等进行检测分析,以了解TMPRSS11f在胚胎发育、生长和生存、以及血细胞成熟过程中的生物学作用。(1)利用免疫组化技术检测TMPRSS11f蛋白在人组织中的表达定位。(2) 利用RT-PCR技术检测Tmprss11fmRNA在小鼠组织中的表达分布。(3)利用免疫组化技术检测Tmprss11f蛋白在小鼠组织中的表达定位。(4) 利用CRISPR/Cas9技术建立Tmprss11f基因敲除小鼠。(5) 利用RT-PCR技术从mRNA水平验证TMPRSS11f基因敲除。(6) 分析杂合子间交配得到的新生和断乳后小鼠基因型比例。(7) 检测Tmprss11f基因敲除小鼠体重增长及长期生存状况。(8) 检测Tmprss11f基因敲除小鼠交配后每胎仔数。(9) 检测Tmprss11f基因敲除小鼠血细胞以及血生化指标。(10)利用苏木素伊红染色观察Tmprss11f基因敲除小鼠组织形态。(11)通过伤口愈合以及游泳实验,分析Tmprss11f基因敲除对小鼠伤口愈合、皮肤保湿以及体温调节能力的影响。(1) TMPRSS11f表达于人类及小鼠的气管、食管、皮肤等组织。(2) TMPRSS11f定位于人类及小鼠表皮组织中的皮脂腺以及气管的粘膜层等。(3) 表型分析显示,与野生型小鼠相比,Tmprss11f基因敲除小鼠的生长发育、生育能力以及组织形态没有明显的区别。(4) 血常规、血生化实验显示,野生型和Tmprss11f基因敲除小鼠的各指标没有明显差异。(5) Tmprss11f基因敲除小鼠伤口愈合、皮肤保湿及体温调节的能力未见明显异常。我们发现TMPRSS11f广泛表达于人类及小鼠的上皮组织中,包括皮肤的皮脂腺、气管的纤毛以及腺体等。通过对构建的Tmprss1 1f基因敲除小鼠的表型分析,发现在我们的实验条件下,Tmprss11f基因的缺失对小鼠胚胎发育、生长成熟、生育能力、长期生存、血细胞生成以及皮肤的功能没有明显的影响。Tmprss11f基因敲除小鼠的表型可能需要在进一步的实验刺激条件下才能显示出来。我们构建的Tmprss11f基因敲除小鼠可作为进一步研究TMPRSS 11f生理和病理功能的一个重要动物模型。
[Abstract]:The purpose of this study was that Type 鈪，

本文编号：2501752