山核桃RCA基因克

发布时间：2019-07-14 20:23

【摘要】：山核桃(Carya cathayensis Sarg.)是重要的木本油料作物,生产中易受到自然逆境胁迫因素影响,尤其是高温,高温下严重限制植物光合作用致使山核桃生长,结实,有机物积累等都受到影响。因此,对山核桃光合作用相关基因的开发和利用具有重要的意义。在高等植物中光合作用关键步骤固定CO2过程需要Rubisco酶的催化,Rubisco酶的活性由植物体内复杂的机制进行调控,其中大量研究已证实Rubisco activase(RCA)能够活化并维持Rubisco酶的催化活性。同时RCA也被认为是植物在各种不同环境胁迫下对光合作用的关键调控因素。因此,Rubisco活化酶的功能研究对于增强植物体内Rubisco酶活性稳定光合作用系统,进而提高植物适应逆境的能力具有重要作用。本试验通过应用RACE技术,克隆得到了山核桃2个RCA基因的全长cDNA序列,命名为CcRCAα和CcRCAβ。序列开放阅读框长度分别为1419bp、1302bp,推测编码472和433个氨基酸。利用DNAMAN软件对山核桃RCA基因与葡萄等物种的RCA氨基酸序列进行的多重序列比对,结果表明,两者氨基酸序列相似性很高,且与葡萄等物种的RCA序列同源性高达87%以上。本试验还得到了山核桃另一个RCA基因cDNA序列,命名为CcRCAβ2,分析表明,其氨基酸序列与CcRCAβ的相似性高达96%以上,同属于β类型RCA基因。此外,本文以pET28a+载体为表达载体,构建了载有山核桃CcRCAα的原核表达载体,通过IPTG法诱导BL21(DE3)表达菌株表达具有可溶性的RCA异源蛋白,并经条件优化得到原核表达的最适条件:培养基体积20ml中加入终浓度1mM的IPTG经28℃诱导4-6小时。为进一步研究山核桃RCA基因的功能奠定了基础。本文还对山核桃RCA基因在高温胁迫下的表达模式进行了研究,结果表明,高温下山核桃光合速率、Rubisco酶活力及RCA基因转录和翻译水平呈下降趋势,高温抑制山核桃光合作用,可能通过影响RCA基因的转录、翻译进而导致RCA酶含量的变化。深入研究发现嫁接山核桃对高温胁迫的抵御能力高于未嫁接山核桃,H-L嫁接(湖南山核桃为砧木)的光合速率和Rubisco酶活在41℃时下降幅度最小分别为12.8%和19.9%较其他品种抗高温性能更好,除了砧木因素外M-L嫁接(美国山核桃为砧木)较好的抗高温性还可能与CcRCAβ2基因的表达调控有关。以上结果说明山核桃RCA基因在高温胁迫中发挥了重要的作用,为进一步研究RCA基因与植物抗逆性的关系提供依据。
文内图片：山核桃总RNA提取（M:DL2000marker;1:RNA条带）

图片说明： s.ucl.ac.uk/psipred/），进行蛋白质二级结构预测；利ww.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)程序，预测蛋白质的ver（http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/）程序，cTP）；采用 PSORT（http://www.psort.org/）程序， ClustalX2.1 进行蛋白同源序列比对；采用 MEGA对和系统进化树分析。析叶片总 RNA 的提取B 法联合 Trizol 法提取山核桃叶片的总 RNA，，经泳结果显示：有 28S、18S 和 5S 三条清晰泳带 NanoPhotometer 测得 260nm 和 280nm 波长处的吸280nm 比值介于 1.8-2.0 之间。同时电泳结果也表明
文内图片：内参β-actin检验cDNA(M:DL2000marker;1:β-actin条带)

内参β-actin检验cDNA(M:DL2000marker;1:β-actin条带)

图片说明： 2.2 内参β-actin 检验 cDNA(M:DL2000 marker;1: β-actinphoresis map of cDNAband for house-keeping gene β-actin.β-actin band)化酶基因中间片段获取RNA 反转录合成的 cDNA 第一条链为模板，根据比对，结合部分山核桃转录组序列设计的特异性T-PCR 扩增。扩增产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳检存在一清晰的泳带。该泳带的大小与预测片段大片段。PCR 产物凝胶回收后克隆到 PMD-vector1通过 GenBank 数据库 BLASTn，表明其与其他物
【学位授予单位】：浙江农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S664.1

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