酿酒酵母中SSK2基因与其他镉耐受相关基因之间的双基因缺失菌株构建

发布时间：2019-07-19 06:14

【摘要】：镉是一种严重的环境污染物,对人体具有致癌性,能蓄积在生物体内影响机体的生长、发育和生殖。有丝分裂原蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)在调节细胞存活、增殖和分化中是重要的信号分子,并能够被镉胁迫激活。酿酒酵母中2个MAPK信号传导途径,高渗透压甘油(High Osmolarity Glycerol,HOG)途径和细胞壁完整性(Cell Wall Integrity,CWI)途径都参与Cd2+胁迫下的细胞应答。为了进一步研究这两条途径在调控Cd2+胁迫方面的相互作用,以HOG途径的蛋白激酶SSK2基因为例,通过合成遗传阵列(Synthetic Genetic Array,SGA)方法,成功构建了SSK2基因与其他52个Cd2+耐受相关基因之间的双基因缺失菌株。为大规模研究Cd2+耐受基因之间在调控镉胁迫方面的遗传学相互作用奠定了基础,也为酿酒酵母的相关研究提供了一个新的遗传学手段。
文内图片：

2454背景里的靶菌株ssk2::natMX4构建Fig．1Generationofthessk2::natMX4mutant

图片说明： ?个CWI信号途径的组分［11］。为了研究HOG和CWI两个途径之间，以及它们和其他Cd2+耐受性相关基因之间，在调控Cd2+胁迫方面的遗传相互作用，需要构建HOG和CWI信号途径组分基因之间以及它们和其他基因之间的双基因缺失突变株。为了建立这个大规模构建双基因缺失突变株的方法，这里仅以SSK2基因为例，拟构建SSK2与其他88个与Cd2+耐受有关的基因之间的双基因缺失株。本研究利用SGA方法［14-15］的原理进行构建。首先获得Y2454背景下的ssk2::natMX4单基因缺失株作为靶菌株，其基因型验证如图1B。图1Y2454背景里的靶菌株ssk2::natMX4构建Fig．1Generationofthessk2::natMX4mutantinY2454backgroundA:PCＲ扩增BY4741背景里ssk2::kanMX4敲除盒(第1泳道);CK:BY4741菌株里野生型SSK2基因片段的PCＲ;B:Y2454背景里ssk2::natMX4基因型验证(第1泳道);CK:Y2454菌株里缺失基因ssk2::kanMX4片段的PCＲA:PCＲamplificationofthessk2::kanMX4cassettefromtheBY4741background;CK:PCＲamplificationoftheSSK2genefromtheBY4741background;B:Genotypeverificationofthessk2::natMX4alleleintheY2454background;CK:PCＲam-plificationofthessk2::kanMX4alleleintheY2454background1期熊兵等:酿酒酵母中SSK2基因与其他镉耐受相关基因之间的双基因缺失菌株构建53
文内图片：

图片说明： 2．2SGA缺失株阵列的获得为了提高菌株构建效率，将88个BY4741背景下的基因缺失株依次点接在影印板的a、b、c和d四个区域，每个区域的菌株及排列顺序都相同(图2)。图288个SGA缺失株阵列分布Fig．2Distributionof88SGAgenedeletionmutantsarraya、b、c和d四个区域均有96个点接位置，影印板中装有YPD+150μg/mLG418固体培养基。30℃培养1dEachoffourdistrictsofa，b，canddhas96spotsforinoc-ulation．TheplatecontainingYPD+150μg/mLG418solidmediumisculturedforonedayat30℃2．3SGA筛选双基因缺失株SGA原本是用来进行高通量合成致死型分析的，在这里被用来筛选双基因缺失株(图3)。靶菌株ssk2::natMX4是MATα型的，而带有kanMX4标签的SGA阵列菌株是MATa型的，它们在YPD培养基上进行杂交，产生MATα/a型的双倍体菌株，同时带有kanMX4和natMX4这2个遗传标签。双倍体菌株在产孢培养基上生成四分孢子，孢子有MATa和MATα两种交配型。MFA1pr-HIS3报告子只在MATa型的细胞中才能表达，所以在SD-HIS的培养基上就能够筛选出MATa型的单倍体孢子。此外，CAN1基因编码一种高亲和性通透酶，刀豆氨酸和精氨酸都是通过这种通透酶进入细胞的。因为刀豆氨酸是精氨酸的类似物，对细胞具有毒害作用，所以在缺少精氨酸的SD+刀豆氨酸(L-Canavanine)的培养基中，含有CAN1基因的菌株是致死的，因为它们摄取了刀豆氨酸，刀豆氨酸会代替精氨酸合成蛋白质，由于结构的不同导致蛋白功能出现异常，致使细胞死亡。因此，利用SD-His-Arg+L-Canavanine培养基就能够筛选出不含有亲本的MATa型单倍体孢子。最后利用YPD+G418+NAT培养基筛选出MATa型中的ssk2::natMX4xxx::kanMX4双基因缺失株(图4)。图3合成遗传阵列(SGA)方法［16］Fig．3Syntheticg
【作者单位】：江南大学生物工程学院粮食发酵工艺与技术国家工程实验室;
【基金】：国家自然科学基金项目(81371784) 江南大学自主研究计划重点项目(JUSRP51313B)
【分类号】：Q933

【相似文献】