靶向hnRNP K基因siRNA的筛选及其对精原细胞存活的影响

发布时间：2019-07-26 09:32

【摘要】：利用免疫细胞荧光、RNA干涉(RNA interfere,RNAi)、qRT-PCR、Western blot及细胞计数等方法,设计合成三对小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)(siRNA-hnRNP K-1,2,3),对小鼠精原细胞中内源性的不均一性核糖核蛋白K(Heterogeneous ribonucleoproteins K,hnRNP K)进行敲低并对其沉默效率进行筛选,研究其对小鼠精原细胞存活的影响.结果表明,siRNA-hnRNP K-3对小鼠精原细胞具有80%以上的沉默效率,转染后发现细胞数目明显减少,说明沉默hnRNP K基因的表达对小鼠精原细胞的存活有显著影响.
【图文】：

转膜（６０Ｖ，２ｈ），脱脂奶粉封闭２ｈ，４℃一抗孵育过夜，二抗室温孵育２ｈ，最后使用ＥＣＬ发光试剂盒在化学发光成像系统中自动显色成像．２结果与分析２．１ｈｎＲＮＰＫ在小鼠精原细胞中的表达通过免疫细胞荧光技术检测ｈｎＲＮＰＫ在ＧＣ－１ｓｐｇ细胞的表达及定位，结果显示带有红色荧光标记信号的ｈｎＲＮＰＫ与细胞核着色的ＤＡＰＩ蓝色荧光信号强烈且均匀，二者完全重合，如图１，表明ｈｎＲＮＰＫ主要在ＧＣ－１ｓｐｇ的细胞核中具有强表达．图１ｈｎＲＮＰＫ在ＧＣ－１ｓｐｇ细胞中的表达Ｆｉｇ．１ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｎＲＮＰＫｉｎＧＣ－１ｓｐｇｃｅｌｌ２．２ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ干扰效率筛选由以上免疫细胞荧光的结果可知，ｈｎＲＮＰＫ在ＧＣ－１ｓｐｇ细胞核中高表达，提示其可能对精原细胞存活发挥作用．于是设计合成３对ｈｎＲＮＰＫ的干扰序列（ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－１，２，３）及１对阴性对照序列（ｓｉＲＮＡ－ＮＣ）（见表１）．转染ＧＣ－１ｓｐｇ细胞设置ｓｉＲＮＡ转染组（ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－１、２、３）、阴性对照组（ｓｉＲＮＡ－ＮＣ）及空白对照组（Ｍｏｃｋ）三个组别，４８ｈ后，通过ｑＲＴ－ＰＣＲ检测干扰效率．结果表明：与对照组ｓｉＲＮＡ－ＮＣ及Ｍｏｃｋ相比３对ｓｉＲ－ＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ均产生５０％以上的干扰效率，其中ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－３干扰效率在８０％以上，效果最好（见图２）．于是选择ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－３进行下一步的实验．

靶向hnRNP K基因siRNA的筛选及其对精原细胞存活的影响

图２ｑＲＴ－ＰＣＲ筛选ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ干扰效果Ｆｉｇ．２ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｅｆｆｅｃｔｓｓｃｒｅｅｎｅｄｂｙｑＲＴ－ＰＣＲ．注：带有不同小写字母表示基因表达水平差异显著（ｐ＜０．０５）进一步用胰酶将其消化成单细胞进行细胞计数，结果如表２所示，表明转染４８ｈ后，与对照组相比较，ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－３转染组细胞数目显著低于对照组（Ｐ＜０．０５），且两个对照组之间差异不显著（Ｐ＞０．０５）．表２ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－３转染ＧＣ－１ｓｐｇ４８ｈ后细胞计数Ｔａｂ．２ＧＣ－１ｓｐｇｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇａｆｔｅｒｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－３ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｆｏｒ４８ｈ组别接种细胞数目转染４８ｈ后细胞数目ｓｉＲＮＡ－ＮＣ６×１０４３．８３±０．１２×１０５ａＭｏｃｋ６×１０４３．８０±０．１１×１０５ａｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－３６×１０４１．５７±０．０６×１０５ｂ注：带有不同小写字母表示基因表达水平差异显著（ｐ＜０．０５）利用ｑＲＴ－ＰＣＲ和ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技术分别从ＲＮＡ及蛋白质角度检测ｓｉＲＮＡ对ｈｎＲＮＰＫ的沉默效果，结果检测干扰效率均达到８０％以上（见图４），可见ＧＣ－１ｓｐｇ内源性的ｈｎＲＮＰＫ被成功抑制．图３ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－３转染４８ｈ后ＧＣ－１ｓｐｇ的细胞表型Ｆｉｇ．３ＧＣ－１ｓｐｇｃｅｌｌｐｈｅｎｏｔｙｐｅａｆｔｅｒｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－３ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒ４８ｈＡ．ｑＲＴ－ＰＣＲ检测干扰效
【作者单位】：信阳师范学院生命科学学院;
【基金】：国家自然科学基金项目(U1204326) 河南省青年骨干教师资助计划项目(2015GGJS-139) 河南省高等学校重点科研项目(18B230011)
【分类号】：Q132.1;Q78

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