巨桉EgrZFP7基因在非生物逆境响应中功能及调控机制研究

发布时间：2019-07-30 20:57

【摘要】：巨桉为重要用材树种,生长迅速,为我国林业产业发展做出重要贡献。但其对低温敏感,不耐干旱、盐渍,且不良环境常对桉树生产造成重大损失。因此,研究其非生物逆境胁迫响应的分子机制,挖掘桉树抗逆分子调控中发挥重要作用的基因,对桉树抗逆分子辅助育种意义重大。EgrZFP7是参与低温和高盐等逆境因子响应的一个C2H2型锌指结构蛋白转录因子。以拟南芥C2H2型锌指蛋白分类为依据,通过聚类分析结果表明EgrZFP7为C1-2iA类锌指蛋白。其编码蛋白除含有两个高度保守,核心序列为QALGGH的锌指结构域外,还含有1个与蛋白互作相关,富含亮氨酸(Leu)的L-box结构域,1个与转录活性相关的乙烯响应元件结合因子相关双性抑制子EAR基序(ERF-associated amphiphilic repression domain),也称为DLN-box。基因启动子序列上还含有ABRE、DREB和NACF等多个与逆境胁迫相关的顺式作用元件。4℃不同处理时间(0,2,6,12,24,48h)下筛选得到832个与EgrZFP7共表达基因(cor绝对值0.9)。KEGG结果表明,有117个基因可与KEGG途径匹配,其中有71个基因参与基础代谢和次生代谢途径,22个基因参与氨基酸代谢途径,19个基因参与糖代谢。对EgrZFP7正向共表达相关系数最高的20个基因进行分析,发现其中有多个涉及逆境胁迫响应相关的转录因子如MYB、WRKY和ZFP转录因子家族成员等,同时有4个糖基转移酶基因。说明这些基因在巨桉低温逆境响应中,可能与EgrZFP7存在协同作用或调控关系。EgrZFP7超表达拟南芥转化植株中,侧根数目和长度有明显的增加和伸长,但超表达转基因株系低温下敏感程度提高,PEG处理下表现为不定根的伸长受到诱导,而高盐处理下并没有表现出敏感程度的变化。为进一步研究EgrZFP7的功能,构建了PMAL-C2X-Egr ZFP7原核表达载体,进行表达条件筛选与优化。结果表明,该蛋白可在Transetta(DE3)菌株中经0.4mmol?L-1IPTG诱导,在20℃环境中培养14h后在上清中大量表达。对原核表达的EgrZFP7蛋白纯化后,利用CASTing手段筛选EgrZFP7蛋白结合的核心序列。在所分离的片段中,其一致性很强的序列中都含有两个连续的胸腺嘧啶(T),进行多序列比对和构建隐马图分析结果也表明该核心序列至少含有两个连续的碱基T,核心序列可能为[TG][TG][CA]TT[AG][TC][TG]。本研究通过异源转化手段,蛋白表达以及CASTing技术,对EgrZFP7基因在巨桉非生物逆境响应中的功能和调控机制,进行初步研究,丰富了巨桉非生物逆境抗性相关分子机制,为巨桉抗逆分子辅助育种工作提供了一定的理论参考。
【图文】：

图 1.1 响应渗透和低温胁迫基因表达调控网络[20]（Kazuko 等，2006）Fig.1.1 Response to osmotic and hypothermic stress gene expression regulation networks(Kazukoet al,2005)1.1.2.1ABA 依赖途径该途径中，胁迫基因表达依赖内源 ABA 累积和外源 ABA 添加。研究表明拟南芥 AREB/ABF 基因家族基因 AREB1、AREB2 及 AREB3（ABA responsive elementbinding protein）可被干旱、高盐和 ABA 诱导表达，其中 AREB1 和 AREB2 的表达需ABA 激活[21]。拟南芥 ABF2/AREB1 参与 ABA 依赖信号途径，该基因可被高盐胁迫和干旱胁迫诱导表达，其拟南芥超表达植株在应对干旱、高盐、高温和氧胁迫时抗性显著提高。拟南芥 ABF3 或 ABF4/AREB2 参与 ABA 信号传导途径，组成型超表达该基因可减弱蒸腾作用并显著提高超表达植株耐干旱能力[22]。拟南芥 CIPK3 基因响应ABA、低温、高盐和干旱胁迫，并参与 ABA 信号途径，但响应冷胁迫时需要依赖内源 ABA 的大量累积[23]。番茄（Lycopersicon esculentum）基因 SIAREB1 可被干旱和高盐诱导表达，该基因在拟南芥中组成型表达，在外源 ABA 处理下，拟南芥超表达植株中逆境相关基因 AtRD29A 和 AtCOR47 表达量显著增加[24]。水稻 OsABF2 基因可被干旱、高盐、低温、氧胁迫和 ABA 诱导表达，其超表达植株对干旱、高盐和氧化胁

巨桉EgrZFP7基因在非生物逆境响应中功能及调控机制研究

根据半胱氨酸（C）和组氨酸（H）残基数目和位置可将锌指蛋白分为 C2H2、C2HC、C2C2、C2HCC2C2、C2C2C2C2 等亚类[55]。从锌指蛋白结构特征和所发挥功能差异方面可将锌指蛋白分为 WRKY、GATA、PHD、DOF 和 TFⅢA 蛋白等亚类[56, 57]。绝大多数TFⅢA类锌指蛋白都属于C2H2型锌指蛋白。该类锌指蛋白锌指结构域（Zincfinger domain）由约 30 个氨基酸组成，核心序列为 CX2-4CX3FX5LX2HX3-5，，该结构域内锌与两个半胱氨酸和及两个组氨酸结合形成配位键，构型成含有 α 螺旋和 β 发夹的锌指结构域。不同植物 C2H2 型锌指蛋白所含锌指结构域数目为 1-4 个，其结构域 α螺旋区一般含有一段植物所特有的高度保守 QALGGH 序列[58]。该类锌指蛋白序列往往还包含一个与亚细胞定位相关的核定位信号区 B-box/NLS,一个与蛋白互作的富含亮氨酸（Leu）的 L-box 结构域和一个靠近 C 端与转录活性相关的乙烯响应元件结合因子相关双性抑制子 EAR 基序/DLN-box（图 1.2b）。研究表明，缺少 B-box 结构域后，拟南芥蛋白 AtZFP11 与 GFP 不能融合，无法在细胞核表达[59]。有一些锌指蛋白没有 B-box 结构域，有一些没有 L-box 结构域，但大部分都含有 DLN-box 结构域[55]。ZPT2-3、STZ 和 CAZFP1 缺失 EAR 结构域其转录活性会被抑制[60, 61]。
【学位授予单位】：浙江农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S792.39

【参考文献】