角蛋白酶基因gm2886在密旋链霉菌ACT12中的表达及鉴定

发布时间：2019-08-08 20:05

【摘要】：通过生物信息学分析,在本实验室分离得到的1株羽毛高效降解菌微白黄链霉菌Fea-10基因组中发现基因gm2886(GenBank Accession Number:KY368946)可能编码一新的角蛋白酶,通过在该基因5'端和3'端分别连接红霉素抗性基因启动子(PermE)和组氨酸标签编码序列并构建在大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pSET152上,接合转入密旋链霉菌Streptomyces pactum ACT12,从而实现了异源表达,蛋白纯化后对其酶学性质进行了研究。实验结果表明,带有组氨酸标签编码序列的gm2886在密旋链霉菌ACT12中可以表达分泌得到1个大小约为36 kDa的蛋白。多种底物检测表明异源表达得到的重组蛋白GM2886-His6具有蛋白酶活性,可以降解水不溶性的天青角蛋白和羽毛粉;其最适温度和pH分别为50℃和pH 10.0。PMSF可抑制GM2886-His6的酶活,而EDTA不能,说明该酶为丝氨酸蛋白酶。本研究为从分子水平上解析羽毛高效降解菌Fea-10的活性机理,从而进一步开发其应用潜力提供了基础,同时可为该类蛋白酶的研究提供借鉴。
【图文】：

马怡茗等/角蛋白酶基因gm2886在密旋链霉菌ACT12中的表达及鉴定：010-64807509：cjb@im.ac.cn1973图1GM2886与几种已知的链霉菌来源角蛋白酶的成熟酶序列同源性分析Fig.1SequencealignmentofmatureproteinsequenceofGM2886andseveralotherknownkeratinases.图2密旋链霉菌ACT12/pSET152::Perm::gm2886牛奶平板复筛Fig.2SecondaryscreeningofStreptomycespactumACT12/pSET152::Perm::gm2886usingmilk-agarplate.1:wildtypeACT12;2:ACT12/pSET152::Perm::gm2886.使用酪蛋白为底物进行非变性蛋白电泳，在重组蛋白对应位置可以出现透明条带(图4)，表明该纯化到的蛋白具有蛋白水解活性。3.3重组蛋白GM2886-His6的产量与酶活对纯化到的重组蛋白产量进行测定，得到重组蛋白GM2886-His6在密旋链霉菌ACT12中的异源表达产量为1.108mg/L。以酪蛋白为底物测得重组蛋白的最大酶活为5.36kU/mg。

马怡茗等/角蛋白酶基因gm2886在密旋链霉菌ACT12中的表达及鉴定：010-64807509：cjb@im.ac.cn1973图1GM2886与几种已知的链霉菌来源角蛋白酶的成熟酶序列同源性分析Fig.1SequencealignmentofmatureproteinsequenceofGM2886andseveralotherknownkeratinases.图2密旋链霉菌ACT12/pSET152::Perm::gm2886牛奶平板复筛Fig.2SecondaryscreeningofStreptomycespactumACT12/pSET152::Perm::gm2886usingmilk-agarplate.1:wildtypeACT12;2:ACT12/pSET152::Perm::gm2886.使用酪蛋白为底物进行非变性蛋白电泳，在重组蛋白对应位置可以出现透明条带(图4)，，表明该纯化到的蛋白具有蛋白水解活性。3.3重组蛋白GM2886-His6的产量与酶活对纯化到的重组蛋白产量进行测定，得到重组蛋白GM2886-His6在密旋链霉菌ACT12中的异源表达产量为1.108mg/L。以酪蛋白为底物测得重组蛋白的最大酶活为5.36kU/mg。
【作者单位】： 西北农林科技大学生命科学学院;中国科学院微生物研究所;
【基金】：陕西省农业科技创新与攻关(No.2015NY066) 上海交通大学微生物代谢国家重点实验室开放基金(No.MMLKF14-09) 中央高校基本科研业务费(Nos.Z109021426,Z109021432) 国家自然科学基金(No.31601700)资助~~
【分类号】：Q78

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本文编号：2524574