Nramp1基因定点整合转基因山羊的制备

发布时间：2019-08-13 11:31

【摘要】：结核病是威胁全球健康的慢性传染性人畜共患病,目前缺乏有效的预防和根治方法。目前认为结核病的发病机理是:致病性结核分支杆菌通过呼吸系统进入体内,与肺部巨噬细胞膜表面受体结合后形成吞噬小体,通过获取铁等金属离子,产生大量活性酶类,从而抵抗巨噬细胞的杀伤作用,在细胞内寄生,从而难以治愈。Nramp1蛋白的功能之一是将金属离子从吞噬体内腔转运到细胞质内,通过限制金属离子限制病菌生产活性酶的能力,阻止结核分支杆菌的增殖。通过转基因手段来增强羊Nramp1基因过表达,培育抗病种群,可成为控制羊结核病一个新的切入点。Cre/loxp位点特异性重组系统由Cre重组酶和loxp位点两部分组成,Cre重组酶不仅具有催化活性,而且与限制酶相似,能识别特异的DNA序列,即loxP位点,使loxP位点间的基因序列被删除或重组。该定点整合方法主要有以下优点:(1)外源基因能够准确地整合到宿主染色体的特定位点;(2)减少转基因生物中外源基因的拷贝数,整合上的外源基因多数都是未发生重排的单拷贝。本研究主要通过Cre/loxp重组酶系统将Nramp1基因定点整合入人溶菌酶转基因山羊细胞内,从而通过核移植方法制备抗结核分支杆菌的Nramp1转基因山羊。首先分离了人溶菌酶高表达转基因山羊耳成纤维细胞3-376♂,其基因组内包括盒式交换系统loxp1-Neo-Tk-loxp表达框架,并且此框架中loxp序列为突变型,即将野生型loxp位点的反向重复序列“ATAAC”突变为“CACCT”。人工合成含有Nrampl基因的表达框架,第132位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为苏氨酸(T),此突变蛋白特异性表达于巨噬细胞中,具有抗胞内菌活性,尤其适用于预防和治疗胞内菌引起的感染。通过酶切,连接等步骤得到框架为 loxp2-polyA-Nrampl-Purocoda-loxp 的Nramp1 定点表达载体质粒 pTM-Nramp1。将上述pTM-Nramp1质粒与pBS185质粒共同转染3-376♂细胞,嘌呤霉素抗性筛选得到22株克隆,经PCR及测序鉴定,其中3株目的基因已经整合到预定位点,为定位整合阳性细胞株,整合效率为13.6%(3/22),挑取其中状态良好的11号细胞作为体细胞核移植的核供体。挑选50头2岁左右健康母羊作为供体羊,同步发情,超数排卵处理后获得卵母细胞总数为155个,移核卵数111个,融合后获得重构胚105株,融合率94.59%(105/111),移植入13头受体母羊输卵管内。35天后进行B超妊娠检查,共检查到6头母羊出现孕囊,怀孕率为46%(6/13)。47天时剖腹取出一个胎儿,155天顺产获得一只健康公羊,经PCR方法和测序鉴定,此胎儿和新生小羊均为Nramp1定位整合转基因公羊,该公羊目前仍然健康,这为Nramp1转基因羊的扩繁奠定坚实的基础。
【图文】：

图１－１巨噬细胞内ＮＲＡＭＰ丨介导的二价金属离子流出机制模式图Ｍ逡逑膜上的黑色小圆圈代表ＮＲＡＭＰ１蛋白。细菌细胞膜上的黑色小圆圈代表ＮＲ物。此图显示的是动物的ＮＲＡＭＰ１和细菌的ＮＲＡＭＰ１在争夺各自生命活动所价金属离子。逡逑

使用ＲＨＹＴＨＭ程序进行穿膜螺旋（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｈｅｌｉｃｅｓ邋）分析（ｈｔｔｐ：／／逡逑ｐｒｏｔｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．邋ｃｈａｒｉｔｅ．ｄｅ／ｒｈｙｔｈｍ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｓｉｔｅ＝ｈｏｍｅ），结果表明山羊天然邋ＮＲＡＭＰ１邋蛋逡逑白有１２个跨膜区，即有６个膜内袢，５个膜外袢（如图１－２），第１，３，邋５，邋７，邋９和１１袢逡逑位于膜外侧，第２，邋４，邋６，邋８，，１０袢位于膜内侧，其Ｎ端和Ｃ端均位于膜内侧。１－８跨膜逡逑区具有高度的同源性。膜内袢８有一个多种细菌和真核生物膜上转运蛋白体进化上高逡逑度保守的转运功能域［１１］。逡逑虽然ＮＲＡＭＰ１的各个跨膜区及各袢的具体功能还未能完全揭示，但膜内区对于激发逡逑囊泡内的生物学功能具有潜在功能。经生物信息学分析以及对区段和位点的筛选发现，山逡逑羊ＮＲＡＭＰ１膜内袢２上有一个潜在的蛋白激酶Ｃ邋（ＰＫＣ）磷酸化位点ＴＧＫ邋（１１４－１１６）和逡逑一个潜在的酪蛋白激酶ＩＩ邋（ＣＫ２）的磷酸化位点ＴＧＫＤ邋（１１４邋－１４７）。蛋白激酶Ｃ活化了逡逑Ｎａ＋、Ｋ＋交换系统、使细胞内Ｈ＋减少、提高细胞质中的ｐＨ，还提高了邋Ｎａ＋／Ｋ＋泵的运转。逡逑在神经传导过程中，ＣＫ２通过磷酸化突触结合蛋白、突触融合蛋白和发动蛋白２］调节了逡逑突触小泡的跨膜运输，形成了一种调节突触效率的突触前作用机制。突触结合蛋白的跨膜逡逑域涉及突触小泡与突触前质膜间相互作用的调节。突触融合蛋白具有调节突触结合蛋白与逡逑Ｎ２型Ｃａ２＋通道间相互作用的功能。发动蛋白２１在复极化时，ＰＫＣ磷酸化可诱导除去Ｃａ２＋；逡逑而在去极化时
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.27

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本文编号：2526095