牡丹蔗糖转运蛋白基因PsSUT2的克隆及表达分析

发布时间：2019-08-13 15:54

【摘要】：蔗糖是植物体中重要的碳源物质,参与植物的生长、发育乃至信号转导等多个生理过程。植物体在长距离运输蔗糖的过程中,蔗糖转运蛋白(sucrose transporters,SUT)基因起关键作用。为了解该基因在牡丹(Paeonia suffruticosa)植株体内的转运机制,以洛阳红牡丹(P.suffruticosa'Luoyanghong')为材料,利用反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)和RACE(rapid-amplification of cDNA ends)方法从叶片中克隆了蔗糖转运蛋白基因,命名为PsSUT2。该基因全长2 347 bp,包含1 803 bp的开放阅读框,编码601个氨基酸,Gen Bank登录号为KC542396,相对分子量为64.6 k D,等电点为6.14,与葡萄(Vitis vinifera)中的蔗糖转运蛋白基因同源性最高,为75.27%。该蛋白属于易化子超家族(major facilitator superfamily,MFS)成员,包含12个跨膜螺旋。采用qRT-PCR和离子色谱法研究牡丹不同生育期与不同组织部位中PsSUT2基因的表达量及可溶性糖的含量变化,结果表明,在牡丹的年生长周期中,PsSUT2在牡丹的根、老茎、叶和鳞芽(花瓣)中均有表达,但主要在盛花期的花瓣中大量表达,相对表达量为11.18,是同时期根的4.26倍、小风铃期根的4.40倍、圆桃期花瓣的10.48倍、鳞芽分化期鳞芽的30.55倍,与同时期的其他部位乃至其他时期的所有部位相比差异显著,因此推测该基因可能参与了"库"端蔗糖的卸载。蔗糖、葡萄糖和果糖的含量在不同生育期、不同部位间存在较大差异,盛花期到来之前,鳞芽(花瓣)中蔗糖含量几乎为0,而葡萄糖和果糖水平较高,说明洛阳红牡丹花瓣属于己糖(葡萄糖和果糖)积累型器官,己糖的不断积累有利于花朵的开放。相关性分析表明,PsSUT2的表达量与与叶片中蔗糖的含量及根中葡萄糖含量成显著负相关,说明该基因的表达可能受叶片中蔗糖及根中葡萄糖的反馈抑制。本研究结果为进一步了解PsSUT2基因的功能、利用该基因进行牡丹分子育种和遗传改良提供理论依据。
【图文】：

牡丹,洛阳,PCR扩增

CarboPacPA10分离柱(4mm×250mm)与CarboPacPA10保护柱(4mm×50mm)，化学工作站版本是Chromleon6.1，流动相A：蒸馏水，流动相B：250nmol/LNaOH溶液。2个流动相体积比V(A)∶V(B)=80∶20，流速0.8mL/min，柱箱温度30℃，电化学检测器(温度30℃,进样量25μL)。待测样品过0.22μm滤膜后上机进样，测定结果回收率：蔗糖95.51%，葡萄糖93.32%，果糖95.21%。标样蔗糖等购自Sigma公司(美国)。2结果与分析2.1牡丹PsSUT2的克隆以展叶期洛阳红叶片的cDNA为模板，通过PCR扩增，获得长度为987bp的中间片段(图1A)。Blastn比对分析表明，该片段与杜仲(Eucommiaulmoides)(AAX49396)、碧桃(Prunuspersicaf.duplex)(EMJ23234)、葡萄(Vitisvinifera)(ADP37122)和车前(Plantagoasiatica)(CAD58887)SUT基因的氨基酸序列同源性高达81%，认为该片段为牡丹SUT基因序列。基于保守区序列，通过3'和5'RACE扩增，获得基因序列的3'端和5'端。3'RACE扩增得到991bp的片段(图1B)，登录NCBI网站进行核酸序列比对，表明该片段序列与可可(Theobromacacao)(KF776548.1)、碧桃(XM_007221973.1)、葡萄(FQ394908.1)和杜仲(AY946204.1)等植物的SUT2基因序列同源性高达78%，确认其为牡丹PsSUT2基因3'端序列。5'RACE扩增得到一个长为745bp的片段(图1C)，登录NCBI网站进行序列比对，确认其为PsSUT2基因5'端序列。使用DNAMAN软件对所得到的基因序列进行拼接，获得全长cDNA序列，将其定名PsSUT2。序列长为2347bp，包含1803bp的开放阅读框，编码601个氨基酸。3′非翻译区长213bp，5′非翻译区长328bp，该蛋白质具有2个高度保守的盒子(box)，即DSAPLLN(293~299)和VLVNLLTSVR(358~367)。GenBank登录号：KC542396。2.2牡丹PsSUT2同源性比对及分子?

牡丹,氨基酸

ransport-er2)结构比较类似，推测SUT2可能有糖感应子的功能(杨彩菊等,2006)。本研究克隆得到的牡丹PsSUT2基因，共编码601个氨基酸，其含有1个535个氨基酸(63~598)蔗糖转运子组成的保守结构域，含有一个483个氨基酸(66~549)MFS功能域，，属于MFS蛋白家族。该蛋白有12个跨膜螺旋，疏水性氨基酸分布在整个肽链中，且大部分区域为疏水区，N端有一个57个氨基酸的延长区域，比PsSUT1多出了26个氨基酸，中央环区的长度为99个氨基酸(276~375)。较长的N端氨基酸序列可能决定了底物亲和性(Schulzeetal.,2000)，而中央环对转运图4牡丹PsSUT2跨膜结构域分析Figure4TransmembranedomainanalysisofPsSUT2ofPaeoniasuffruticosa-6000-5000-4000-3000-2000-10000100020003000基氨分值酸heTminoacidacores0100200300400500600i=＞00=＞i氨基酸位置Theaminoacidsite574
【作者单位】：河南农业大学林学院;鹤壁市淇滨区园林局;
【基金】：河南省科技攻关项目(No.102102110033) 郑州市重点科技攻关计划项目(No.30800472)
【分类号】：S685.11

【参考文献】