斜纹夜蛾Cyp10基因的克隆及表达载体构建

发布时间：2019-09-08 14:24

【摘要】：亲环蛋白10(Cyclophilin 10,Cyp10)是亲环蛋白家族成员之一,这是一类广泛存在于真核及原核生物内的蛋白家族,其共性是都具有肽基脯氨酰顺反异构酶(Peptidyl-prolyl cis-trans isomerases,PPIase)活性。有研究表明,Cyp10可能参与了肿瘤细胞凋亡蛋白胞质分布的调控,但在昆虫先天免疫中的作用没有见到报道。本研究以斜纹夜蛾Spodoptera litura为研究对象,以寄生后斜纹夜蛾血细胞转录组数据中发现的特异cyp10序列为基础,通过RT-PCR克隆出了cyp10基因,通过生物信息学方法对此序列进行开放阅读框分析(Open Reading Frame,ORF)和序列同源性比对,发现cyp10基因ORF全长486 bp,编码161个氨基酸,具有肽基脯氨酰顺反异构酶家族标签序列:YNGSLFHRNIKGFIVQTG,因此确定为亲环蛋白基因家族成员。构建了包括ORF全长编码区的原核表达载体p ET32a-Cyp10及真核表达载体p IZT/V5-His-Cyp10,经Western blot证明,p ET32a-Cyp10和p IZT/V5-His-Cyp10可分别在大肠杆菌和鳞翅目昆虫细胞系(Hi5,Sf9和Spli221)中表达,蛋白分子量分别是26 k Da和22 k Da。之后以细胞免疫荧光定位法探索Cyp10在家蚕细胞Bm N内的分布,发现Cyp10主要分布于细胞质内。这些结果为进一步探索Cyp10在昆虫先天免疫中的作用奠定了一定基础。
【图文】：

)洗两次(10min×2)，再加入二抗AlexaFluor溲568GoatAnti-ＲabbitlgG(H+L)(1∶2000)孵育1h。1×PBS洗两次(5min×2)，加入鬼笔环肽稀释40倍(1×PBS配制)，37℃孵育30－60min。1×PBS洗一次(5min)。加入DAPI(终浓度为300nmol/L)室温孵育5min。荧光显微镜观察。2结果与分析2.1斜纹夜蛾cyp10基因的克隆通过对寄生后斜纹夜蛾血细胞转录组测序结果的分析，，获得了cyp10基因cDNA的预测序列。以此为模板，设计特异性引物(表1)，以提取斜纹夜蛾血细胞mＲNA反转录获得的cDNA为模板，PCＲ扩增获得了一条490bp的特异性片段(图1)。通过NCBI在线OＲF查找工具，找到了特异的cyp10基因序列，根据OＲF设计了带有酶切位点的引物(表1)，为后面表达载体的构建做准备。图1斜纹夜蛾中cyp10基因的PCＲ扩增产物Fig.1PCＲproductofcyp10inSpodopteralitura590

环境昆虫学报JournalofEnvironmentalEntomology39卷图2斜纹夜蛾Cyp10与其它物种的同源比对Fig.2MultiplesequencealignmentofCyp10fromSpodopteraliturawiththosefromotherspecies注:实心箭头指示的是亲环蛋白家族标签序列;空心箭头指示的是磷酸化位点。大红斑蝶，EHJ72048.1;家蚕，XP_004928560.1;人类，NP_570981.1;斑马鱼，NP_001002146.1。Note:ThesolidarrowindicatesthetagsequenceofCyclophilinproteinfamily;thehollowarrowindicatesthephosphorylationsites.Danausplexippus，EHJ72048.1;Bombyxmori，XP_004928560.1;Homosapiens，NP_570981.1);Daniorerio，NP_001002146.1．图3斜纹夜蛾Cyp10与其他物种Cyps的系统进化树Fig.3PhylogeneticanalysisbasedonaminoacidsequencesofSpliCyp10proteinandotherinsectcyclophilinproteins592
【作者单位】： 云南大学生命科学学院云南省高校动物遗传多样性和进化重点实验室;
【基金】：国家自然基金项目(31360454,31260448,31560528) 云南省应用基础研究计划项目(2012FB120)
【分类号】：S433.4

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