鼠疫耶尔森氏菌waaA，cmk，ail基因突变与噬菌体抗性关系的研究

发布时间：2019-09-12 23:24

【摘要】：鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌(以下简称鼠疫菌)引起的一种自然疫源性烈性传染病,历史上曾发生过三次人间鼠疫大流行引起数以亿计的人死亡,给人类带来巨大的灾难。鼠疫可经过跳蚤等节肢动物的叮咬从而传染给人类,且如果没有得到及时治疗,可发展为败血症或可通过空气传播的肺鼠疫。故鼠疫在我国被规定为甲类传染病。此外,鼠疫菌又是一种生物战剂和恐怖剂,威胁着人类的安全。因此鼠疫的防治对人民健康安全、经济发展和社会稳定依然具有重要意义。在我国,Yep-phi主要用于鼠疫菌的诊断,且属于T 7类家族。随着多重耐药菌株的出现,使噬菌体治疗得以重新重视。宿主菌与噬菌体“共进化”生活方式也是研究病原菌和宿主相互作用的理想模型。前期工作中,由青海地方病控制所使用鼠疫弱毒菌614F,在Yep-phi噬菌体压力下连续培养,诱导出对Yep-phi具有抗性的突变株614F-S43。将614F-S43与共传代的614F的基因比对,发现waaA,ail,cmk基因发生突变。现在201菌株对这三个基因进行无痕修饰,并进行相关的表型实验,论证该三个基因在噬菌体抗性中的发挥的作用。首先通过在鼠疫菌中建立无痕修饰技术平台,分别对waaA,ail,cmk三个基因进行单基因修饰,两两基因修饰和三基因修饰,得到7株突变株。分别是waaA(△9nt),cmk(△10nt),ail(△A),waaA(△9nt)/cmk(△10nt),waaA(△9nt)/ail(△A),cmk(△10nt)/ail(△A)和waaA(△9nt)/cmk(△10nt)/ail(△A)。通过菌株与噬菌体的相关表型实验,主要测定噬菌体对修饰菌株的感染能力、吸附能力、成斑能力,我们发现waaA(△9nt)的抗噬菌体能力与△waaA相同,并且强于野生型。通过提取LPS,发现waaA缺失9个碱基后鼠疫菌LPS的结构受到破坏。通过蛋白信息学的分析和圆二色光谱的验证,WaaA(△9nt)蛋白比WaaA蛋白相比,结构发生改变,α螺旋增多,β折叠减少。通过PDB库比对,超嗜热菌WaaA蛋白与鼠疫菌WaaA蛋白同源性较高,且发现超嗜热菌中缺失位置为WaaA蛋白与脂质A前体的磷酸基团结合的位置,所以我们推测鼠疫菌中waaA的9个碱基缺失导致WaaA不能与脂质A前体共价结合,LPS结构不完整,从而可以抑制噬菌体通过LPS吸附宿主菌。由EditSeq软件分析和LC-MS/MS结果说明cmk的10个碱基缺失后,导致翻译提前终止,产生不完整蛋白,导致CMP/dCMP不能合成CDP/dCDP,影响宿主的Yep-phi不能获得CTP或dCTP作为噬菌体DNA聚合酶的底物,影响DNA的复制,从而起到抗噬菌体的作用。在cmk(△10nt)中构建Cmk蛋白过表达载体,抗噬菌体的能力下降,说明cmk缺失确与噬菌体抗性相关。ail(△A)的抗噬菌体能力也与△ail一致。但是相比于cmk,waaA,ail的抗噬菌体能力最弱,但是ail却是最后发生突变。由于耐受菌与噬菌体相互作用时,我们人为干预耐受菌的生长,确保每代耐受菌在噬菌体的培养压力之前生长状态良好。26℃培养条件下,生长曲线结果也显示cmk(△10nt)/ail(△A)生长速度远远大于ail(△A)和野生株水平。所以我们推测ail突变发生是一种适应性消耗(fitness cost)后的补偿性突变。它不仅能抑制噬菌体对其吸附,而且在共生存状态下,对于菌体恢复自身的生长有重要作用。本研究将waaA基因的重要性定位于三个氨基酸,从面到点推进waaA与噬菌体耐受的研究。验证了cmk的缺失会起到抗噬菌体的作用,而且作用能力很强,能耐受107 PFU的噬菌体。且推测ail的作用不止是Yep-phi特异性受体,而且是一种适应性消耗后的补偿性突变,与菌株自身恢复生长有很大关系。本研究结果在病原-宿主相互作用的层面,解析鼠疫菌和噬菌体这对矛盾体在噬菌体裂解构成中的复杂变化,不仅可以加深我们对于鼠疫菌的认识,也诠释了噬菌体压力下鼠疫菌适应性消耗的进化过程。
【图文】：

图 1 噬菌体的复制周期Fig 1 Phage replication cycle体实验仍是鉴定鼠疫菌的重要方法。鼠疫噬菌体根据其、抗原性和随对鼠疫菌的特异性水平的不同，，将其分最多且最为常见，以烈性诊断用噬菌体为代表。包括ph包括 33 株噬菌体。它们具有等距六角形头部和一个短尾部，故也属于短尾噬菌体科（Podoviridae），C1 形现，血清型 1 噬菌体能特异性裂解 74 100%的鼠疫菌、菌（Yersinia pseudotuberculosis, 以下简称假结核菌）菌（Yersinia enterocolitica）、大肠埃希菌（E. coli）。志贺菌

5图 2 四株噬菌体基因组结构比较[18]Fig 2 Common genes of lytic Y. pestis phages灰色箭头为共有基因，黑色箭头为某些噬菌体特有基因。4. 本研究的目的和意义鼠疫噬菌体因对宿主的高度特异性和敏感性，故在临床诊断和流行病学上有重要的价值与意义。1915 年，就有学者使用噬菌体来治疗鼠疫，但是随着抗生素的出现，噬菌体的研究治疗中断了，而美国又将抗生素的生产研究推到一个更高的高度。但是近年来 随着多重耐药鼠疫菌的出现，使人类的健康又面临巨大
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R378.61


本文编号：2535415